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摘要胰腺导管腺癌（简称胰腺癌）是一种恶性程度极高的肿瘤，且大约40％的患者在诊断时就已发生局部浸润或转移，仅10％～20％的患者有机会接受手术治疗。胰腺癌对多数抗肿瘤治疗如化疗、放疗和免疫治疗不敏感是导致其预后恶劣的原因之一。<br>　　 上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transitions，EMT)是指在某些特殊的生理或病理条件下，上皮细胞表型的缺失及间质特性的获得，细胞的迁移和运动能力的增强。EMT现象在胚胎发育、组织发生以及多种慢性疾病的发生过程中起重要作用。Twist是一种位于常染色体上的碱性螺旋-环-螺旋(basic Helix-loop-Helix，bHLH)类型的转录因子，近年来越来越多的研究发现，Twist是参与EMT过程中的关键调控因子，在多种肿瘤细胞的增殖分化、转移、侵袭以及抗凋亡等过程中起重要作用，与多种肿瘤例如乳腺癌、食管癌、胃癌及前列腺癌等的病理分期、较差预后及转移相关。同时，Twist也是一种凋亡抑制蛋白，其过量表达往往预示着肿瘤的侵袭性增加、生存率低和预后差，它促进细胞集落形成、阻止细胞凋亡、参与肿瘤的耐药和转移。<br>　　 然而，Twist在胰腺癌的发生发展以及放疗抵抗中的作用尚缺乏深入的研究，其分子调控机制尚不十分清楚。因此，本研究通过建立体外及体内的放射干预、治疗模型，探讨Twist在125I放射性粒子低剂量率照射诱导胰腺癌放射抵抗中的作用并探讨其机制。<br>　　 一、Twist在人胰腺癌细胞株中的表达及其与低剂量率照射诱导胰腺癌细胞放射抵抗的关系<br>　　 目的:检测Twist在人胰腺癌细胞株中的表达情况，通过125I放射性粒子离体装置短时低剂量率照射胰腺癌细胞株，探讨Twist及其相关基因表达与胰腺癌细胞株放射抵抗的关系。<br>　　 方法:采用RT-PCR、QPCR及Westem印迹技术，分别从基因和蛋白水平检测Aspc-1、SW1990、Pane-1及Capan-2等4种胰腺癌细胞株中Twist的表达情况。采用125I放射性粒子离体装置，给予照射组细胞4Gy的总照射剂量，照射过程中动态观察细胞形态学变化;并检测Twist、E-cadherin及其他相关基因在胰腺癌细胞株照射前后的变化情况。<br>　　 结果:Twist在四种胰腺癌细胞株中均有表达;给予4Gy短时低剂量率的照射后，可见各胰腺癌细胞发生了不同程度的EMT现象。Twist、E-cadherin及其相关基因表达量在胰腺癌Pane-1细胞株照射前后的差异有统计学意义(P＜0.05)。<br>　　 结论:Twist通过抑制E-cadherin的表达，促使胰腺癌细胞发生EMT现象，参与低剂量率照射诱导的放射抵抗。<br>　　 二、Twist与125I放射性粒子瘤体内植入诱导人胰腺癌细胞裸鼠原位移植瘤放射抵抗的关系<br>　　 目的:通过125I放射性粒子瘤体内植入，探讨Twist在短时低剂量率照射诱导裸鼠原位胰腺癌发生放射抵抗中的作用，为临床上短时低剂量率放疗所产生的放射抵抗机制提供一定的理论依据。<br>　　 方法:采用原位注射胰腺癌细胞株的方法建立人胰腺癌细胞裸鼠原位移植瘤模型，用超声内镜高频探头监测瘤体生长规律;当体外监测瘤体长径达到1.0cm左右时，行瘤体内放射性125I粒子植入术。植入240小时后处死裸鼠，测量肿瘤体积及质量，采用HE染色观察肿瘤细胞形态学变化，并用免疫组织化学方法、Western印迹法检测Twist在照射前后的表达变化情况。<br>　　 结果:植入125I放射性粒子后肿瘤体积较对照组缩小，在Pane-1和Capan-2两组中瘤体体积差异有统计学意义(P＜0.05)。HE染色结果示125I放射性粒子瘤体内植入后，肿瘤细胞体积较对照组明显增大，细胞表现为排列松散，细胞间质成分增多等形态。免疫组化、Western印迹结果均显示，125I粒子瘤体内植入前后，在AsPC-1、Panc-1及Capan-2三组中，Twist及E-cadherin的表达量变化均有统计学意义(P＜0.05)。<br>　　 结论:125I放射性粒子瘤体内植入可以有效抑制肿瘤生长;短时低剂量率照射同时可以诱导肿瘤细胞发生EMT现象，Twist在这一过程中发挥了一定的作用。<br>　　 三、Twist基因慢病毒干扰载体的构建及验证<br>　　 目的:构建有效的以慢病毒为载体以Twist为靶基因的siRNA序列，高效干扰胰腺癌细胞中Twist表达。<br>　　 方法:根据目的基因Twist信息，利用软件设计多个RNA干扰靶点，选择最优的4个靶点构建慢病毒载体框架、转染感受态细胞、进行阳性克隆测序。采用四质粒系统进行病毒包装。包装好的病毒感染人胰腺癌Panc-1细胞，通过QRT-PCR及Western印迹结果验证，选择最有效的干扰靶点。<br>　　 结果:pLVT504、pLVT505、pLVT506、pLVT507的干扰效率有统计学意义（P＜0.05），其中pLVT506、pLVT507为干扰Twist最有效靶点。<br>　　 结论:成功构建了高效干扰Twist表达的慢病毒载体，为后续实验的进行奠定了基础。<br>　　 四、干扰Twist表达对抑制胰腺癌细胞放射抵抗的作用研究<br>　　 目的:探讨干扰Twist的表达对抑制胰腺癌细胞放射抵抗的作用，明确Twist在胰腺癌细胞放射抵抗中的作用。<br>　　 方法:用包装好的慢病毒载体感染胰腺癌细胞Panc-1后，用嘌呤霉素筛选得到稳定表达的细胞株;采用体外照射平板装置对稳定表达的细胞进行短时低剂量率的照射诱导，总吸收剂量达到4Gy后，用流式细胞仪检测细胞凋亡率的变化情况;并通过细胞迁移和侵袭实验观察Panc-1细胞运动和侵袭能力的变化。<br>　　 结果:慢病毒感染的胰腺癌细胞Panc-1经短时低剂量率的照射诱导后，细胞总凋亡率为(30.87±0.14)％，与其余对照组相比，差异有统计学意义;细胞迁移实验结果显示Twist-siRNA组细胞迁移能力下降，24小时穿膜细胞数为(29.0±6.89)个，与Twist-NC[(74.0±5.10)个]相比，差异有统计学意义(P＜0.05);侵袭实验结果显示Twist-siRNA组细胞侵袭能力下降，72h穿膜细胞数为(29.6±4.78)个与Twist-NC组[(99.6±16.0)个]相比，差异有统计学意义（P＜0.05）。<br>　　 结论:Twist是短时低剂量率照射诱导胰腺癌放射抵抗发生过程中的关键分子，其可能通过抑制凋亡来参与了胰腺癌细胞放射抵抗。