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摘要尽管近些年对肿瘤的发病机理取得了深刻的认识，在肿瘤的治疗方面取得了极大的进步，但是肿瘤依然存在，肿瘤发病率在世界范围内逐渐的增加。与感染性疾病有效的预防性疫苗不同，肿瘤治疗性疫苗治疗效果有限。使用肿瘤治疗性疫苗治疗肿瘤好比是使用乙型肝炎病毒或者人乳头瘤状病毒疫苗去治疗慢性乙型肝炎病毒感染或者人乳头瘤状病毒感染一样非常具有难度。之前的研究报道了几种可能的机制来解释肿瘤逃逸和免疫抑制。肿瘤逃逸和免疫抑制可能是肿瘤长期的发生和发展引起的，包括T细胞反应的损伤，免疫耐受和抑制性的肿瘤微环境，这些因素可能是协同起作用的。因此迫切需要开发出肿瘤预防性疫苗，肿瘤预防性疫苗是低价的和高效的肿瘤防治的方案。设计肿瘤预防性疫苗的一个难点是分离鉴定安全且具有免疫原性的并且具有有效靶向的肿瘤抗原，包括肿瘤特异性的抗原和正常组织中不表达而肿瘤组织中高表达的蛋白。至今，只成功的鉴定出有限数量的肿瘤抗原。但是肿瘤具有很大的异质性，单价肿瘤抗原的疫苗可能很难发挥有效的作用。目前，肿瘤预防性疫苗缺乏有效的设计和相应的实现手段。<br>　　 很多的研究已经报道肿瘤细胞能够表达各种似胚胎的抗原，肿瘤组织和胚胎组织表达的抗原具有高度的相似性，这种特性为靶向胚胎抗原作为预防肿瘤发生提供了有效的方法。胎盘组织同样高表达肿瘤相关的抗原，包括IGF2，HIF-2α，GPC3，PAPP-A，和MUC1等。而gp96作为热休克蛋白HSP90家族的一员，具有结合抗原多肽的独特的能力，gp96与抗原呈递细胞细胞膜表面的受体结合将结合的抗原多肽交叉呈递给MHCⅠ和MHCⅡ类分子，激活特异性的T细胞反应。我们实验室之前的研究证实了在乙型肝炎病毒引起的肝癌中，gp96能够结合乙型肝炎病毒来源的多肽。临床上使用自体gp96-多肽复合物治疗性疫苗已经开始治疗多种肿瘤，但是自体gp96-多肽复合物疫苗来源有限严重影响了疫苗的疗效。基于以上两方面的研究，本论文的目的是探索胎盘来源的gp96能否激活预防性的抗肿瘤的T细胞反应，以及其发挥作用的具体作用机制。<br>　　 1、P-gp96激活抗B16-F10黑色素瘤和TUBO乳腺癌特异性的T细胞反应<br>　　 胎盘组织来源的gp96(P-gp96)，肝脏组织来源的gp96(L-gp96)和PBS皮下免疫C57BL/6小鼠或者BALB/c小鼠三次，最后一次免疫后一周小鼠皮下接种B16-F10黑色素肿瘤细胞或者TUBO乳腺癌肿瘤细胞。与L-gp96或者PBS免疫相比，P-gp96免疫能够显著地抑制肿瘤的生长，降低肿瘤体积和延长小鼠的存活率。酶联免疫斑点实验结果表明P-gp96免疫显著地增加肿瘤特异性的T细胞。此外杀伤实验表明，与L-gp96免疫相比，P-gp96免疫有效地激活了高细胞毒性的CTLs。<br>　　 2、P-gp96免疫抑制DMBA诱发的大鼠乳腺癌的发生和HER2转基因鼠自发乳腺癌的发生和生长<br>　　 使用大鼠胎盘来源的gp96免疫大鼠完全的抑制7，12-二甲基苯并[a]蒽(DMBA)诱发的乳腺癌肿瘤的发生。FVB/N-Tg(MMTVneu)202Mul/J小鼠胎盘来源的gp96免疫FVB/N-Tg(MMTVneu)202Mul/J转基因鼠显著的抑制自发乳腺癌肿瘤的发生和生长。<br>　　 3、P-gp96可能结合Muc1和Her2来源的多肽<br>　　 实时荧光定量PCR结果显示小鼠，大鼠和人的胎盘组织中肿瘤相关的基因（MUC1， HER2/ERBB2， MMP2， FGF2， c-Myc和VEGF-a）的表达水平显著地高于肝脏组织。基质辅助激光解析离子化串联飞行时间质谱的结果显示P-gp96结合了大量分子量从700到1，500 Da的多肽。酶联免疫斑点实验结果显示P-gp96免疫BALB/c小鼠显著的增加Kd限制性Her2显性表位E63特异性的T细胞。P-gp96，三氟乙酸处理后的P-gp96(TFA-gp96)和PBS体外刺激人的PBMCs细胞，酶联免疫斑点实验结果表明P-gp96处理能够显著的激活Muc1和Her2表位肽特异性的CTLs。此外，P-gp96处理PBMCs能够显著的增加PBMCs对MUC1阳性的MCF-7乳腺癌细胞系的杀伤能力。本实验结果揭示了胎盘来源的gp96的新的免疫原性，以及其作为多价的肿瘤预防性的疫苗的潜在应用价值，为开发人用预防性肿瘤疫苗提供了科研依据。<br>　　 在小鼠模型和临床实验已经证实热休克蛋白gp96作为免疫佐剂能够结合抗原，并通过抗原交叉呈递激活抗肿瘤和感染性疾病的T细胞反应。gp96进入抗原呈递细胞内部是gp96介导的T细胞反应至关重要的一步。本实验阐明了增强gp96进入抗原呈递细胞的能力和激活T细胞的方法。研究结果表明将TAT多肽与gp96融合能够降低大肠杆菌表达的gp96的聚集，显著地增强gp96进入巨噬细胞的能力。来源于乙肝病毒主要的抗原（表面抗原，核心抗原和聚合酶）三种已知的Kd限制性的表位肽HBc87-95，HBs362-371和HBV pol140-148作为抗原肽，单独免疫或者与rTAT-gp96，rgp96共同免疫HBV转基因小鼠三次。酶联免疫斑点实验结果表明rTAT-gp96作为佐剂能够有效地激活HBc87-95，HBs362-371和HBVpol140-148表位肽特异性的T细胞反应。流式细胞术检测T细胞激活的标志CD69的结果显示与 rgp96-多肽复合物免疫相比，rTAT-gp96-多肽复合物免疫的小鼠脾脏淋巴细胞中CD69+CD8+和CD69+CD4+T细胞的比例显著地增加。IFN-γ细胞内染色结果表明与rgp96-多肽复合物免疫相比，rTAT-gp96-多肽复合物免疫的小鼠脾脏淋巴细胞中分泌IFN-γ的CD8+和分泌IFN-γ的CD4+T细胞的比例也显著地增加了。杀伤实验结果表明rTAT-gp96-多肽复合物免疫显著地增加HBc87-95，HBs362-371，和HBV pol140-148表位肽特异性的CTLs的细胞毒性。rTAT-gp96-多肽复合物免疫HBV转基因小鼠能够显著的降低血清中的乙肝病毒的DNA拷贝数，血清中表面抗原的水平以及肝脏细胞中乙肝病毒核心抗原的水平。此外，在小鼠B16-F10黑色素肿瘤模型中，TAT多肽显著地增强了gp96疫苗的抗肿瘤活性。本实验结果为有效的增强gp96进入抗原呈递细胞能够显著地增强以gp96为基础的免疫治疗的效果提供了依据，同时为提高gp96这一独特的免疫佐剂的免疫调节功能和佐剂功能提供了有效的方法。