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摘要一、人源mRNA稳定蛋白HuR的结构与功能研究<br>　　 哺乳动物细胞中，mRNA的降解受到精确调控，这一调控机制需要顺式作用元件和反式作用因子的相互作用。其中研究得最详细的顺式作用元件是位于mRNA3'-非编码区的富含AU序列的元件（ARE）。这一序列元件最显著的一个特征就是具有数目和分布不等的AUUUA五联体核苷酸。目前已经鉴定出二十多种结合ARE的蛋白，包括本篇论文的研究对象HuR(human antigen R)。HuR蛋白属于脊椎动物Hu家族成员，该家族蛋白还包括HuB、HuC和HuD。HuR分子量约为36 kDa，它的表达不具有组织特异性。这个蛋白含有三个RNA识别基序（RRM），其中N端两个串联的RRM结构域（RRM1/2）可以以高亲和力结合ARE，而位于C端的第三个RRM结构域则可以结合poly(A)尾巴和其他的蛋白配体。HuR被认作是一个关键的转录后调节蛋白而受到越来越多的关注。小角散射实验(SAXS)结果显示HuR的构象在结合底物RNA前后发生了很大的变化。但迄今为止还没有晶体结构从细节上验证这一结果。故研究HuRRRM1/2识别底物RNA的分子机制具有其实际意义。<br>　　 本论文中，我们解析了HuR RRM1/2无底物状态时的晶体结构。该结构呈现一种开放的构象，两个RRM结构域之间不存在任何相互作用。突变实验证实HuR RRM1/2与其他RRM结构域一样也是通过它的β片结合RNA的。我们同时也解析了HuR RRM1/2结合11个碱基RNA(5'-AUUUUUAUUUU-3')复合物的晶体结构。该复合物的结构则是一种闭合的状态。RRM1/2通过一个碱性的沟槽结合底物RNA。荧光偏振实验结果显示RRM1是最主要的RNA结合结构域。通过结合自由能分析以及荧光偏振的实验结果分析，我们得出这样的推论，RRM1首先结合了底物RNA，随之HuR RRM1/2构象发生巨大变化，这样的变化使得RRM2和RRM1/2之间的linker提供更多的与RNA结合的接触面积，以此大大增强了HuR与RNA的亲和力。<br>　　 二、酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶3(GAPDH3)的结构与功能研究<br>　　 糖酵解途径是细胞产生ATP的重要方式。甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH，EC∶1.2.1.12)是糖酵解过程中一个关键的酶。在无机磷酸和辅因子NAD+存在时，GAPDH将底物甘油醛-3-磷酸(GAP)转化成1，3-二磷酸甘油酸。GAPDH的分子量约为37 kDa，主要存在于细胞质中，也可以在不同细胞器之间穿梭。近些年来越来越多的实验证据显示GAPDH具有多种糖酵解过程外的功能。例如:DNA损伤修复、细胞凋亡、膜融合、tRNA转运以及mRNA稳定性调节等。已经有多个物种的GAPDH的晶体结构得到解析，但是关于GAPDH识别RNA的分子机制还不是很清楚。酿酒酵母中一共存在三个异构体形式的GAPDH:GAPDH1、GAPDH2和GAPDH3。之前的研究表明酵母中只有碱性最强的异构体(GAPDH1)具有结合poly(U)的能力。但是我们通过荧光偏振实验显示其中偏酸性的异构体GAPDH3也具有结合RNA的能力。<br>　　 为了研究GAPDH3结合RNA的分子机制，我们解析了GAPDH3的晶体结构。酿酒酵母的GAPDH3与其他物种的GAPDH具有十分相似的总体结构:NAD+结合结构域（氨基酸残基1-149）和催化结构域（氨基酸残基150-332）。溶液状态下GAPDH3以同源四聚体的形式存在。酶活实验结果显示，GAPDH3对于NAD+的表观米氏常数约为682μM。荧光偏振实验结果表明GAPDH3可以结合mRNA(5'-AUUUAUUUAUUUA-3')，其解离常数Kd约为18μM。辅因子NAD+可以抑制其RNA结合能力且这种抑制作用呈浓度依赖型。关于GAPDH3结合RNA的分子机制的进一步研究正在进行中。<br>