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摘要自《黄帝内经》已有心身疾病相关记载，赵志付教授在欧阳琦教授和董建华教授指导下，结合数十年临床经验，以内经“心身合一论”、“天人合一论”为基石，创造了以“先治其心，而后医其身”为治则的中医刚柔辨证理论，用于诊疗现代社会新出现的心身疾病，疗效显著，其学术思想获国内外同行一致好评。本研究以确定刚柔证模型入手，从神经内分泌免疫多个角度对大鼠模型进行中药干预前后各指标进行检测，结合行为学测试，从而进一步在确定造模方法的科学性的基础上研究刚证、柔证的神经内分泌免疫基础及探寻刚柔辨证治疗的机理。<br>　　 目的:<br>　　 1、刚柔辨证可分二纲四型十六证，其中首分刚证与柔证。采用国际上通用的行为学的检测方法来对各种心身刚柔证造模方法进行客观评价，将最符合刚柔证核心症状的造模方法作为本研究后继实验刚柔证的造模方法。<br>　　 2、通过对照实验，从多个系统指标及行为学指标的测定确定刚证、柔证大鼠模型可靠性及该证神经内分泌免疫机理，同时探索疏肝方、柔肝方治疗柔证和刚证的机制。<br>　　 方法:<br>　　 1、刚柔证模型复制部分成年SD雄性大鼠40只适应环境饲养7d后，随机分为五组:①正常对照组;②刚证打斗组;③刚证睡眠剥夺组;④柔证束缚组;⑤柔证长期慢性应激组，各组动物数均为8只。正常组大鼠正常喂养21d，刚证睡眠剥夺组采取小站台水环境技术，进行48h的睡眠剥夺。刚证打斗组孤养，每天固定时间将同组两只大鼠放于一个笼子，使其相互打斗5min，持续14d。柔证束缚组:不孤养，每天用布袋包裹全身束缚5min，每次用塑料夹夹大鼠鼠尾根部2min，持续14d。柔证长期慢性应激组同样采用孤养，进行慢性不可预知应激造模21d。造模完成后进行行为学检测，包括:实验开始后每天称量大鼠体重，计算第1、7、14、21天各组大鼠体重并进行比较;进行高架十字迷宫测试，每只大鼠测试5 min，观察并记录大鼠进入开放臂次数、开放臂停留时间、进入封闭臂次数、封闭臂停留时间。进行旷场试验，观察5 min内大鼠活动情况。计算大鼠5 min运动总路程及粪便颗粒数;分别在第1天与造模完成后进行糖水试验，计算动物的总液体消耗、糖水消耗、纯水消耗、糖水偏爱;攻击行为测定则观察8 min内大鼠活动情况，分别计算大鼠8 min内攻击行为的时间和比例。<br>　　 2、柔证模型及药物机理研究在动物房适应性饲养7d后，将实验大鼠随机分为正常对照组、柔证模型组、西药治疗组、中药治疗组，进行第一次蔗糖水消耗实验。之后给予柔证模型组、西药治疗组、中药治疗组大鼠连续21d慢性不可预见温和应激，同时分别给予西药治疗组、中药治疗组西医药物和中医药物治疗。21天内记录四组大鼠体重数值，之后四组进行旷场试验、十字高架平台实验、攻击行为观察实验和第二次蔗糖水消耗实验，实验之后即断头取脑组织、胸腺、脾和周围血。采用酶联免疫吸附法(ELISA)方法检测各组外周血ACTH、CORT、5-HT和NE水平，下丘脑CRF、5-HT和NE的水平。采用Western-blot方法检测各组大鼠海马、皮层BDNF、p-CREB、p-ERK、c-fos、c-jun和CREB，杏仁核c-fos、c-jun总蛋白表达水平。采用还原酶法方法检测各组大鼠海马、杏仁核NO水平。采用RT-PCR的方法检测海马、杏仁核的BDNF、c-fos、c-jun的mRNA表达水平，采用流式细胞术的方法来测定各组大鼠胸腺细胞的凋亡情况，并通过组织切片来初步判定各组大鼠胸腺和脾的组织改变情况。<br>　　 3、刚证模型及药物机理研究在动物房适应性饲养7d后，将实验大鼠随机分为正常对照组、刚证模型组、西药治疗组、中药治疗组，进行第一次蔗糖水消耗实验。之后刚证模型组、西药治疗组、中药治疗组大鼠连续14d每天固定时间将各组内两只大鼠放于一个笼子，使其与组内大鼠相互打斗，每次打斗5min，每天上午和下午各打斗1次，1天共2次，造模过程持续14 d，同时分别给予西药治疗组、中药治疗组西医药物和中医药物治疗。14 d内记录四组大鼠体重数值。14d后四组进行旷场试验、十字高架平台实验、攻击行为观察实验和第二次蔗糖水消耗实验，其余检测方法同实验二。<br>　　 结果:<br>　　 1、刚柔证模型复制部分造模第14天与第21天，与对照组比较，长期慢性应激组大鼠体重增长缓慢(P＜0.05，P＜0.01)，睡眠剥夺组第2天与第1天的体重差异没有统计学意义(P＞0.05)。造模后完成后，打斗组、睡眠剥夺组及长期慢性应激组在高架十字迷宫试验中的开臂时间百分比明显低于对照组(P＜0.05)，打斗组和睡眠剥夺组大鼠旷场试验中活动总路程高于对照组(P＜0.05)，其中打斗组的活动距离长于睡眠剥夺组（P＜0.05）;长期慢性应激组大鼠旷场活动总路程低于对照组（P＜0.05）;同时睡眠剥夺组、打斗组和长期慢性应激组大鼠旷场活动粪便颗粒数多于对照组。各组动物在造模前糖水偏爱度基线组间比较差异无统计学意义(P＞0.05)，造模完成后，束缚组及长期慢性应激组糖水偏爱度明显低于对照组(P＜0.05);并且前者低于后者(P＜0.05)。打斗组大鼠的攻击行为百分比明显高于对照组(P＜0.01);其他组和对照组差异均无统计学意义(P＞0.05)。<br>　　 2、柔证模型及药物机理研究造模第21d，与正常组比较，模型组大鼠体重明显下降(P＜0.01);西药组和中药组体重明显高于模型组(P＜0.05);模型组高架十字迷宫试验中的开臂时间百分比和次数百分比均明显低于正常组(P＜0.05);西药组开臂时间百分比和次数百分比明显高于模型组(P＜0.05);中药组开臂时间百分比明显高于模型组(P＜0.05)。旷场试验中，模型组总路程明显低于正常组(P＜0.05);与模型组比较，西药组和中药组均能提高旷场试验中大鼠总路程长度(P＜0.05)。模型组糖水偏爱度低于正常组(P＜0.05);西药组和中药组的糖水偏爱度明显高于模型组(P＜0.05)，但两组间差异无统计学意义(P＞0.05)。造模完成后各组之间攻击行为比例差异均无统计学意义(P＞0.05)。<br>　　 21天干预完毕后检测发现，与正常组比较，干预完毕后模型组的外周血清ACTH、CORT和下丘脑CRF水平明显升高(P＜0.05或P＜0.01);而西药组和中药组大鼠外周血的ACTH、CORT水平均明显低于模型组(P＜0.05)。模型组的外周血清、下丘脑5-HT水平明显低于正常组(P＜0.05);西药组和中药组大鼠下丘脑的5-HT水平均高于模型组（P＜0.05），但两组间差异无统计学意义(P＞0.05)。模型组的下丘脑、外周血清NE水平明显低于正常组（P＜0.01，P＜0.05）;而西药组和中药组大鼠下丘脑的NE水平均较模型组升高(P＜0.05)，两组间差异无统计学意义(P＞0.05)。模型组大鼠杏仁核、海马及皮层c-fos、c-jun水平与正常组比较显著升高(P＜0.05或P＜0.01)，西药组和中药组中杏仁核、海马c-fos、c-jun水平明显低于模型组（P＜0.05或P＜0.01），西药组皮层c-fos、c-jun水平及中药组皮层c-fos水平均明显低于模型组(P＜0.05或P＜0.01)。模型组大鼠皮层、海马p-CREB、p-ERK、BDNF水平与正常组比较显著降低(P＜0.05、P＜0.01、P＜0.01);西药组和中药组大鼠皮层、海马p-ERK、BDNF水平显著高于模型组（P＜0.01或P＜0.05），其中中药组皮质BDNF水平高于西药组(P＜0.01)。中药组海马p-CREB水平明显高于模型组(P＜0.05)。模型组大鼠海马及杏仁核BDNF mRNA表达水平低于正常组(P＜0.05)，海马及杏仁核c-fos、c-jun mRNA表达水平高于正常组(P＜0.01、P＜0.05);西药组和中药组大鼠海马及杏仁核BDNF mRNA水平均高于模型组(P＜0.05);西药组和中药组大鼠海马c-fos、c-jun mRNA水平均低于模型组(P＜0.05)，西药组杏仁核c-jun mRNA水平低于模型组(P＜0.05)。模型组大鼠海马与杏仁核NO水平高于正常组(P＜0.01)，西药组和中药组海马和杏仁核NO均低于模型组(P＜0.05或P＜0.01)，但两组间差异无统计学意义(P＞0.05)。模型组大鼠胸腺重量和胸腺指数明显低于正常组（P＜0.01， P＜0.05）。西药组胸腺重量高于模型组(P＜0.01)，中药组大鼠胸腺重量和胸腺指数均高于模型组(P＜0.01，P＜0.05)。模型组大鼠胸腺细胞凋亡比高于正常组(P＜0.05)，西药组与中药组胸腺细胞凋亡比明显低于模型组(P＜0.05)，但两组间差异无统计学意义(P＞0.05)。光镜检查各组大鼠HE染色胸腺组织的变化，发现正常组胸腺组织结构完整，皮质和髓质分界清晰;模型组胸腺皮质和髓质均变薄，淋巴细胞排列疏松，基本结构紊乱。西药组胸腺皮质变薄，淋巴细胞排列疏松。中药组皮质和髓质分界清晰，皮质细胞淋巴细胞排列紧密，结构基本正常。对大鼠脾脏进行组织镜检发现:正常组大鼠脾脏红髓白髓结构正常。模型组大鼠脾脏红髓区淋巴细胞疏松，白髓淋巴细胞区增生。西药组和中药组脾脏红髓区淋巴细胞疏松，白髓增生较模型组轻。<br>　　 3、刚证模型及药物机理研究造模14 d完成后检测发现，各组动物在造模前体重基线组间比较差异无统计学意义(P＞0.05)。模型组在高架十字迷宫试验中的开臂时间百分比和次数百分比均明显低于正常组(P＜0.05);与模型组比较，中药组在高架十字迷宫试验中能明显提高开臂时间百分比(P＜0.05)。旷场试验中，模型组总路程明显高于正常组(P＜0.05);与模型组比较，西药组和中药组均能降低旷场试验中大鼠总路程长度(P＜0.05)。各组动物在造模前糖水偏爱基线组间比较差异无统计学意义(P＞0.05)，造模完成各组糖水偏爱度差异均无统计学意义(P＞0.05)。造模完成后与正常组比较，模型组大鼠的非攻击行为时间、攻击行为百分比明显高于正常组(P＜0.01);西药组和中药组与模型组比较，能显著减少攻击行为比例和提高非攻击行为时间(P＜0.05、P＜0.01)，两组间差异无统计学意义(P＞0.05)。<br>　　 与正常组比较，模型组的外周血ACTH、CORT和下丘脑CRF含量水平明显升高(P＜0.01);西药组和中药组大鼠外周血的ACTH、CORT和下丘脑CRF水平均明显低于模型组(P＜0.05)。与正常组比较，模型组的外周血清及下丘脑中5-HT水平明显降低(P＜0.05);西药组和中药组大鼠下丘脑的5-HT水平较模型组升高(P＜0.05)，两组外周血的5-HT水平与模型组差异均不具有统计学意义(P＞0.05);模型组的外周血清中NE水平与正常组比较差异无统计学意义(P＞0.05)，下丘脑NE水平明显高于正常组(P＜0.01);而西药组和中药组大鼠下丘脑NE水平较模型组下降(P＜0.05)。模型组大鼠杏仁核、海马及皮层c-fos、c-jun水平与正常组比较显著升高(P＜0.05或P＜0.01)，西药组和中药组中杏仁核、海马及皮层c-fos、c-jun水平明显低于模型组(P＜0.05或P＜0.01)。模型组大鼠皮层、海马p-CREB、p-ERK、BDNF水平与正常组比较显著降低(P＜0.05、或P＜0.01);西药组和中药组大鼠皮层、海马p-CREB、BDNF水平明显高于模型组(P＜0.01或P＜0.05)，其中中药组BDNF水平高于西药组(P＜0.01)。中药组及西药组皮质p-ERK水平明显高于模型组(P＜0.05)。和正常组比较，模型组海马及杏仁核BDNF mRNA水平降低（P＜0.05），海马c-fos、c-jun mRNA水平上升(P＜0.05、P＜0.01);中药组大鼠海马BDNFmRNA水平高于模型组(P＜0.05);西药组和中药组大鼠海马c-fos、c-jun mRNA水平均低于模型组(P＜0.05，P＜0.01)。模型组大鼠海马与杏仁核NO水平明显高于正常组(P＜0.01)，西药组海马和杏仁核NO低于模型组（P＜0.05）;中药组杏仁核NO水平低于模型组(P＜0.05)，两组间差异无统计学意义（P＞0.05)。实验完成后，模型组大鼠胸腺重量和胸腺指数明显低于正常组(P＜0.01，P＜0.05)。西药组和中药组大鼠胸腺重量和胸腺指数均与模型组没有统计学差异(P＞0.05)。模型组大鼠胸腺细胞凋亡比高于正常组（P＜0.05），西药组及中药组胸腺细胞凋亡率明显低于模型组(P＜0.05)，两组之间差异无统计学意义(P＞0.05)。正常组胸腺组织结构完整，皮质、髓质分界清楚，髓质细胞排列疏松，皮质细胞淋巴细胞排列紧密;模型组胸腺皮质变薄，淋巴细胞排列疏松。西药组和中药组均见胸腺皮质变薄，淋巴细胞排列疏松。对大鼠脾脏进行组织镜检，发现:正常组大鼠脾脏红髓白髓结构正常。模型组大鼠脾脏红髓区淋巴细胞疏松，白髓淋巴细胞区增生。西药组和中药组脾脏红髓区淋巴细胞疏松，白髓淋巴细胞区增生。<br>　　 结论:<br>　　 1、本实验采用改良孤养社会失败造模方法、睡眠剥夺造模方法、束缚造模法、慢性不可预知温和应激造模方法对大鼠予以干预。上述方法均为国内外公认的心身疾病动物模型造模方法，保证本研究的可重复及可操作性。同时结合中医刚柔辨证理论精髓，通过对大鼠体重、十字高架迷宫试验、旷场试验、糖水试验、攻击行为测定试验来综合判定各模型与刚柔证切合度，最后分析确定:采用改良孤养社会失败模型的打斗组大鼠因其在攻击行为测定与旷场试验中结果切合刚证临床核心症状，故而采用其为刚证造模方法;长期慢性应激造模组大鼠因其在糖水试验和旷场试验的结果符合柔证的临床核心症状，故而判定CUMS为柔证造模方法。<br>　　 2、本研究对柔证大鼠行为学及神经内分泌免疫各系统的相关指标进行测定。发现疏肝方能显著改善柔证大鼠抑郁样症状，故而能“以方测证”的反证该造模方法制作柔证模型的可靠性。通过对大鼠各系统指标的比较，发现柔证大鼠其海马、杏仁核、皮层c-fos、c-jun蛋白及mRNA表达均较正常组升高，海马、杏仁核中NO水平上升、BDNF mRNA表达下降、p-CREB、p-ERK和BDNF蛋白水平下降。同时HPA轴外周血ACTH、CORT水平及下丘脑CRF水平含量升高、下丘脑及外周血5-HT及NE水平下降;大鼠胸腺和脾脏镜检及胸腺指数、胸腺细胞凋亡率均表明有免疫抑制。上述指标的变化考虑可能是由应激引起的NO介导c-fos、c-jun等凋亡相关物质水平升高、同时也会引起HPA轴的激活异常以及BDNF水平下调导致Mapk通路的水平下调，可能通过影响神经细胞再生和修复能力导致柔证症状的出现。通过中药疏肝汤的干预，能明显改善大鼠行为学表现，其机理可能与纠正HPA轴激活异常、调节下丘脑5-HT、NE水平有关以及在蛋白或mRNA不同层面对c-fos、c-jun、NO水平的下调、p-CREB、p-ERK和BDNF水平的上调来改善神经细胞再生和修复能力，此外，对主要免疫器官，如胸腺和脾的免疫抑制的改善也是疏肝方改善柔证症状的可能机制。<br>　　 3、本研究对刚证大鼠行为学及神经内分泌免疫各指标进行测定。发现柔肝方能显著改善刚证大鼠攻击行为升高这个核心症状，故而能“以方测证”的反证该造模方法制作刚证模型的可靠性。其次，通过对大鼠各系统指标的比较，发现刚证模型组大鼠其海马、杏仁核、皮层c-fos、c-jun蛋白水平、海马c-fos、c-jun mRNA表达水平均较正常组升高，海马、杏仁核中NO水平上升，海马和杏仁核BDNF mRNA表达下降，p-CREB、p-ERK和BDNF蛋白水平下降。同时HPA轴外周血ACTH、CORT水平及下丘脑CRF水平含量升高，下丘脑及外周血5-HT水平下降、下丘脑NE水平上升。在免疫系统方面，刚证大鼠胸腺重量和胸腺指数下降，细胞凋亡率上升。这些变化表明在刚证模型组中同样存在应激引起一系列HPA轴的激活异常以及脑部c-fos、c-jun等凋亡相关因子影响下丘脑、皮层等部位神经细胞再生和修复能力。而除此之外，刚证动物模型中还存在交感神经-肾上腺髓质系统的激活异常，表现在下丘脑NE水平的升高。通过中药柔肝汤的干预，能明显改善大鼠行为学表现，其机理可能与纠正HPA轴与SAS激活异常、对海马和皮层p-CREB、BDNF蛋白以及皮层p-ERK蛋白水平的上调、海马BDNFmRNA表达的上调以及海马、杏仁核、皮层c-fos、c-jun和NO蛋白及mRNA水平下调有关，此外，柔肝方还能通过降低胸腺细胞凋亡率来改善免疫抑制。