检索历史 清除

摘要目的:<br>　　 1.研究C-Jun氨基末端激酶(JNK/SAPK)信号通路抑制剂SP600125对肺成纤维细胞增殖及磷酸化JNK蛋白表达的影响，明确其适宜的有效浓度，为后期研究作参考。<br>　　 2.观察在白介素(IL)-1β不同的作用时间与浓度下肺成纤维细胞JNK磷酸化水平的变化，明确其量效关系，选择适宜的有效作用时间和浓度，用于后期研究。<br>　　 3.探讨JNK信号转导通路在IL-1β介导的人肺成纤维细胞增殖与活化中的作用。<br>　　 方法:<br>　　 将MRC-5细胞株稳定传代、培养及同步化后，加入不同浓度的IL-1β(0、0.1 ng/ml、1 ng/ml、5 ng/ml、10 ng/ml)刺激1h，或用IL-1β（10 ng/mL）刺激0、15 min、30 min、1h、2h、4h、8h、12h，使用免疫蛋白印迹法(Western Blot)检测细胞JNK/SAPK磷酸化水平;加入不同浓度SP600125（0μmol/mL、1μmol/mL、5μmol/mL、10μmol/mL、20μmol/mL、40μmol/mL、50μmol/mL）处理30 min后，CCK-8法检测细胞的增殖情况，确定适宜浓度范围，采用WesternBlot检测细胞JNK/SAPK磷酸化水平;将实验分为对照组（未干预组）、IL-1β组(10 ng/mL IL-1β)、SP600125组(20μmol/mL SP600125+10 ng/mL IL-1β)，采用Western Blot检测细胞磷酸化JNK(P-JNK)蛋白和α-平滑肌激动蛋白(α-SMA)的表达，RT-PCR检测纤溶酶原激活物抑制剂(PAI-1)、纤维连接蛋白(FN)、神经生长因子(NGF)和α-SMA mRNA的相对表达量，ELISA检测培养上清液中 NGF及白介素(IL)-6的水平。<br>　　 结果:<br>　　 1.SP600125对肺成纤维细胞增殖的抑制作用CCK-8检测结果显示，小剂量JNK抑制剂SP600125不影响成纤维细胞的增殖，当浓度达到40μM时开始明显抑制成纤维细胞的增殖。分别用1μM、5μM、10μM、20μM、40μM、50μM的SP600125处理30分钟后，成纤维细胞的生长抑制率分别为(0.93±0.18)％、(0.916±0.098)％、(0.860±0.130)％、(0.840±0.140)％、(13.910±2.0)％、(24.690±2.170)％。<br>　　 2.Western Blot检测细胞JNK磷酸化水平及α-SMA蛋白表达IL-1ββ促成纤维细胞JNK磷酸化的作用呈浓度依赖性增强，在0 ng/ml、0.1ng/ml、1 ng/ml、5 ng/ml、10 ng/ml IL-1β刺激下P-JNK IOD值分别为0.089±0.018、0.164±0.032、0.282±0.036、0.376±0.058、0.51±0.069,10 ng/mL时JNK磷酸化水平最高;用10ng/ml IL-1β刺激成纤维细胞，结果显示，在不同时间点作用下细胞P-JNK蛋白的表达存在动态变化，0min、15 min、30 min、1h、2h、4h、8h、12h的P-JNK IOD值分别为0.219±0.042、1.824±0.179、1.579±0.142、0.911±0.061,0.712±0.070,0.519±0.091,0.310±0.086,0.221±0.049。 JNK在15 min时出现磷酸化高峰，并维持至30 min，之后磷酸化水平逐渐减低，8h时恢复至正常水平，与0 min相比无显著性差异(P＞0.05);SP600125对成纤维细胞JNK磷酸化的抑制作用呈现浓度依赖性增加，0μM、1μM、5μM、10μM、20μM SP600125作用下P-JNK IOD值分别为0.712±0.07、0.449±0.08、0.221±0.057、0.106±0.024、0.039±0.010，20μM组JNK磷酸化水平最低;20μmol/mL SP600125可抑制JNK磷酸化，其P-JNK IOD值为0.401±0.059，显著低于10 ng/ml IL-1β刺激下P-JNK IOD值(0.729±0.100)(P＜0.05)，而与对照组(0.375±0.051)相比，差异无统计学意义(P＞0.05);SP600125组α-SMA蛋白表达(0.152±0.019)显著低于IL-1β组(0.326±0.024)(P＜0.05)，高于对照组(0.119±0.033)，差异有统计学意义(P＞0.05)。<br>　　 3.RT-PCR检测PAI-1、FN、NGF和α-SMA mRNA相对表达量PAI-1、FN、NGF和α-SMA mRNA的表达呈明显的一致性。IL-1β组[PAI-1mRNA(0.94±0.13)、FN mRNA(0.99±0.17)、NGF mRNA(0.181±0.035)和α-SMAmRNA(0.736±0.11)]均明显高于对照组[PAI-1mRNA(0.37±0.10)、FNmRNA(0.46±0.019)、NGF mRNA(0.042±0.012)和α-SMAmRNA(0.194±0.08)](P＜0.05)。SP600125组均有不同程度的升高，介于对照组和IL-1β组之间(P＜0.05)。<br>　　 4.ELISA检测培养上清液中NGF及白介素(IL)-6的水平IL-1β组培养上清液中NGF水平(206.95±22.37)及IL-6水平(2073.16±175.78)均显著高于对照组[NGF(48.75±12.76)、IL-6(103.46±15.4)](P＜0.05)，SP600125组介于对照组与IL-1β组之间(P＜0.05)。<br>　　 结论:<br>　　 1.IL-1β对人肺成纤维细胞内JNK信号通路的激活呈浓度依赖性。<br>　　 2.IL-1β可诱导人胚肺成纤维细胞的增殖与活化。<br>　　 3.JNK信号转导通路参与IL-1β介导的人肺成纤维细胞增殖与活化。<br>