MicroRNA-21在急性脊髓损伤中的作用及川芎嗪的抗凋亡作用机制研究-论文-万方医学网

MicroRNA-21在急性脊髓损伤中的作用及川芎嗪的抗凋亡作用机制研究

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摘要研究背景： 　　急性脊髓损伤(Spinalcordinjury，SCI)是临床中常见的一类运动系统创伤，可致不同程度的肢体四瘫或截瘫以及劳动能力的丧失，给社会和家庭带来沉重负担。研究表明，细胞凋亡是急性SCI后脊髓继发性损伤加剧的重要原因，减少细胞凋亡对于促进脊髓创伤后修复具有重要意义。 　　MicroRNA(miRNA)是生物体内一类较短（约19～22个核苷酸）的非编码单链小分子RNA，通过与其靶mRNA的3'UTR区以完全互补或部分互补配对的方式相结合，诱导其降解或抑制其翻译的作用，从而发挥其调控基因表达的功能。近年来，有文献报道miR-21与中枢神经系统损伤有关。其中miR-21在许多细胞和动物模型中被证实具有强大的抗凋亡作用，但其在急性SCI中的作用尚未有文献报道。 　　川芎嗪（Tetramethylpyrazine，TMP）是一种从中药川芎中提取的生物活性单体。近年来，本课题组研究表明TMP对急性SCI具有抗凋亡作用。但其抗凋亡机制尚有待进一步研究。为此，本研究以大鼠急性SCI模型为基础，探讨miR-21在急性SCI中是否具有抗凋亡作用及TMP在急性SCI的抗凋亡作用是否与调控miR-21及其凋亡相关靶基因的表达有关。为治疗急性SCI提供新的治疗靶点。 　　第一章MicroRNA在大鼠急性脊髓损伤中的表达谱及其生物学分析 　　目的： 　　探讨miRNA在大鼠SCI后的表达谱变化，分析其可能参与SCI继发性损伤的机制。 　　方法： 　　(1)实验动物分组:成年雄性SD大鼠(180-220g)12只，随机分成4组(n=3):SCI-1d组;SCI-3d组;Sham-1d组;Sham-3d组。SCI-1d和SCI-3d组大鼠采用自制Allen's打击法制作急性脊髓损伤模型;Sham-1d和sham-3d组仅行椎板切除术。 　　(2)总RNA的提取:采用Trizol法提取脊髓组织总RNA。 　　(3)微阵列芯片实验:利用miRCURYTMLNAArray(v.16.0)芯片检测4组中miRNA的表达谱。 　　(4)芯片验证:运用qRT-PCR验证4个差异表达的miRNAs(miR-21、miR-126、miR-24和let-7b)。 　　(5)生物信息学分析:运用Mirbase、Miranda和Mirdb三个靶基因预测软件分析异常表达的miRNAs所调控的靶基因及运用KEGG数据库分析靶基因所涉及的信号通路。 　　结果： 　　(1)microRNA芯片结果:共有22个miRNAs出现异常表达。其中1d组14个:9个miRNAs表达上调，5个miRNAs表达下调;3d组8个:3个miRNAs表达上调，5个miRNAs表达下调。 　　(2)芯片验证:qRT-PCR结果示:miR-21在SCI后1天表达无显著变化，3天表达上调(P＜0.01);miR-126在SCI后1天表达无显著变化，3天表达下调(P＜0.05);miR-24在SCI后1天表达无显著变化，3天表达下调(P＜0.01);let-7b在SCI后1天表达下调，3天表达无显著变化(P＜0.05)。 　　(3)生物信息学分析:miR-21靶基因有22个，miR-24靶基因19个，miR-126靶基因17个，let-7b靶基因7个。pathway分析:这4个验证的miRNAs所调控的靶基因与以下通路有关:Valine，leucineandisoleucinedegradation、Butanoatemetabolism、Endocytosis、Propanoatemetabolism、Fattyacidmetabolism、Tryptophanmetabolism、Lysinedegradation、Wntsignalingpathway、NOD-likereceptorsignalingpathway和Chemokinesignalingpathway。 　　结论： 　　(1)大鼠急性脊髓损伤后miRNA的表达谱发生变化; 　　(2)异常表达的miRNA所调控的靶基因与急性脊髓损伤的病理机制密切相关。 　　第二章MicroRNA-21在大鼠急性脊髓损伤中的抗凋亡作用 　　目的： 　　miR-21在许多细胞及动物模型中被证实具有抗凋亡作用，本实验探讨其在大鼠急性脊髓损伤中是否具有抗凋亡作用。 　　方法： 　　成年雄性SD大鼠(108-220g)56只，以改良Allen's打击法制作急性脊髓损伤(SCI)模型，随机分为Antagomir-21治疗组(n=28)和Negativecontrol治疗组(n=28)。Antagomir-21组大鼠于术后至术后3天予以Antagomir-21治疗，通过胶囊渗透压泵予以鞘内给药（200nmol/ml，1μl/h）（1天组给药至处死前）;Negativecontrol组大鼠予以等量Antagomir-21Negativecontrol作相同干预，给药时间、剂量和速度同Antagomir-21组。每组(n=8)SCI大鼠分别用于检测FasL、PDCD4和PTEN的表达水平（WesternBlot，n=4每个时间点）;每组(n=8)SCI大鼠分别用于检测miR-21的表达量(qRT-PCR，n=4每个时间点);每组(n=8)SCI大鼠分别用于组织化学方面的检测，如免疫组化、TUNEL和原位杂交;每组(n=4)SCI大鼠分别用于行为学评分(BBB评分)和损伤体积的评估，损伤后行为学评估至28天，随后处死用于损伤体积的评估。应用SPSS17.0软件包进行统计分析，组间比较采用T检验，P＜0.05有统计学意义。 　　结果： 　　(1)行为学评分:在SCI后，在两组中均可见大鼠后肢运动功能逐渐恢复。与Antagomir-21组大鼠比较，Negativecontrol组大鼠恢复较快，在SCI14天后BBB评分显著增高(14天，P＜0.05;21和28天，P＜0.01)。 　　(2)组织学评价:在SCI28天后，两组脊髓组织中均可见有空洞形成。Antagomir-21组的空洞体积较Negativecontrol组大，残存正常脊髓组织较后者少。 　　(3)Antagomir-21抑制效果评价:在SCI1和3天，Antagomir-21组大鼠脊髓组织中miR-21的阳性细胞数较Negativecontrol组显著减少(P＜0.05);qRT-PCR结果示:Antagomir-21组大鼠脊髓组织中miR-21的表达量较Negativecontrol组显著减少(P＜0.01)。 　　(4)Antagomir-21对细胞凋亡的影响:在SCI1天，Antagomir-21组大鼠脊髓组织中TUNEL阳性细胞数与Negativecontrol组无显著变化;在SCI3天，Antagomir-21组大鼠脊髓组织中TUNEL阳性细胞数较Negativecontrol组显著减少(P＜0.05)。 　　(5)Antagomir-21对FasL、PTEN与PDCD4表达的影响: 　　1)FasL:Westernblot结果示SCI1天，FasL蛋白两组表达无差异;SCI3天，Antagomir-21组中FasL蛋白的表达量较Negativecontrol组显著增高(P＜0.05)。 　　2)免疫组化结果示PTEN主要在大鼠脊髓组织中的神经元细胞胞浆中表达，亦可见部分神经胶质细胞的胞浆中表达。SCI1天，两组中PTEN阳性细胞数无差异;SCI3天，Antagomir-21组中PTEN阳性细胞数较Negativecontrol组显著增多(P＜0.05)。Westernblot结果示SCI1天，PTEN蛋白两组表达无差异;SCI3天，Antagomir-21组中PTEN蛋白的表达量较Negativecontrol组显著增高(P＜0.05)。 　　3)PDCD4主要在大鼠脊髓组织中的神经元细胞胞浆中表达，亦可见部分神经胶质细胞的胞浆中表达。SCI1和3天，两组中PTEN阳性细胞数无差异。Westernblot结果示SCI1和3天，PDCD4蛋白在两组中表达无差异。 　　结论： 　　(1)miR-21在大鼠急性脊髓损伤中起抗凋亡的作用; 　　(2)miR-21在大鼠急性脊髓损伤中起抗凋亡的机制，可能是通过调控促凋亡靶基因FasL和PTEN的表达其作用。 　　第三章川芎嗪在大鼠急性脊髓损伤中对microRNA-21的调控作用 　　目的： 　　在前期的研究中，已证明TMP在大鼠SCI中具有抗凋亡作用，但其抗凋亡机制仍不明确。本实验探讨TMP在大鼠SCI中能否通过调控miR-21及其凋亡靶基因的表达，影响凋亡细胞的表达。 　　方法： 　　成年雄性SD大鼠(108-220g)52只，以改良Allen's打击法制作急性脊髓损伤(SCI)模型，随机分为TMP治疗组(n=28)和Control治疗组(n=28)。TMP组大鼠于术后30min至术后3天予以TMP治疗，通过腹腔注射给药（200mg/kg，1次/天）（1天组给药至处死前）;Control组大鼠予以等量生理盐水作相同干预，给药时间、剂量和速度同TMP组。每组(n=6)SCI大鼠分别用于检测FasL、PDCD4和PTEN的表达水平(WesternBlot，n=3每个时间点);每组(n=8)SCI大鼠分别用于检测miR-21的表达量（qRT-PCR，n=4每个时间点）;每组(n=8)SCI大鼠分别用于组织化学方面的检测，如免疫组化、TUNEL和原位杂交;每组(n=4)SCI大鼠分别用于行为学评分(BBB评分)和损伤体积的评估，损伤后行为学评估至28天，遂后处死用于损伤体积的评估。应用SPSS17.0软件包进行统计分析，组间比较采用T检验，P＜0.05有统计学意义。 　　结果： 　　(1)行为学评分:在SCI后，在两组中均可见大鼠后肢运动功能逐渐恢复。与Control组大鼠比较，TMP组大鼠恢复较快，在SCI7天后BBB评分显著增高(7和14天，P＜0.05;21和28天，P＜0.01)。 　　(2)组织学评价:在SCI28天后，两组脊髓组织中均可见有空洞形成。TMP组的空洞体积较Saline组小，残存正常脊髓组织较后者多。 　　(3)TMP对miR-21表达的影响:在SCI1和3天，TMP组大鼠脊髓组织中miR-21的阳性细胞数较Control组显著增多(1天，P＜0.05;3天，P＜0.01);qRT-PCR结果示:TMP组大鼠脊髓组织中miR-21的表达量较Control组显著减少(1天，P＜0.05;3天，P＜0.01)。 　　(4)TMP对细胞凋亡的影响:在SCI1和3天，TMP组大鼠脊髓组织中TUNEL阳性细胞数较Control组显著增多(1天，P＜0.05;3天，P＜0.01)。 　　(5)TMP对凋亡基因FasL、PTEN与PDCD4表达的影响: 　　1)FasL:Westernblot结果示SCI1天，FasL蛋白两组表达无差异;SCI3天，TMP组中FasL蛋白的表达量较Control组显著降低(P＜0.01)。 　　2)免疫组化结果示PTEN主要在大鼠脊髓组织中的神经元细胞胞浆中表达，亦可见部分神经胶质细胞、少突胶质细胞胞浆中表达。SCI1天，两组中PTEN阳性细胞数无差异;SCI3天，TMP组中PTEN阳性细胞数较Control组显著减少(P＜0.01)。Westernblot结果示SCI1天，PTEN蛋白两组表达无差异;SCI3天，TMP组中PTEN蛋白的表达量较Control组显著降低(P＜0.05)。 　　3)PDCD4主要在大鼠脊髓组织中的神经元细胞胞浆中表达，亦可见部分神经胶质细胞、少突胶质细胞胞浆中表达。SCI1天，两组中PTEN阳性细胞数无差异;SCI3天，TMP组中PDCD4阳性细胞数较Control组显著减少(P＜0.01)。Westernblot结果示SCI1天，PDCD4蛋白两组表达无差异;SCI3天，TMP组中PDCD4蛋白的表达量较Control组显著降低(P＜0.05)。 　　结论： 　　(1)TMP在大鼠急性脊髓损伤中具有抑制细胞凋亡，减轻脊髓组织损伤，促进运动功能的恢复的作用。 　　(2)TMP在大鼠急性脊髓损伤中的抗凋亡作用可能与调控miR-21及其促凋亡靶基因的表达有关。