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摘要背景:<br>　　宫颈癌是全世界范围内同时也是我国最常见的恶性肿瘤之一，其发生率位居女性生殖系统恶性肿瘤第一位，且有逐年年轻化的趋向。近年来，随着手术切除、化学治疗、放射治疗、及其它综合性治疗措施的应用，对宫颈癌的治疗有了一定程度的进展，但疗效并不十分理想。宫颈癌的病因及发生机制目前尚不十分明了，许多研究证明其发生、发展和浸润、转移是多因素、多阶段、多基因共同参与的非常复杂的过程，因此，探讨宫颈癌的发病机制，寻找更有效的治疗措施是当前研究的热点课题之一。<br>　　LRIGs是最近发现的一组肿瘤相关基因，该家族共有三个成员:LRIG1、LRIG2、LRIG3。LRIGs编码一组结构上较为相似的膜整合蛋白，蛋白分为胞外段、跨膜区和一个胞浆内尾巴，胞外段蛋白含有富含亮氨酸重复序列（LRRs）和3个免疫球蛋白样结构域。研究表明LRIG的表达能够对EGFR信号通路进行调控，从而起到抑制肿瘤生长的作用，但是我们对其分子和信号机制尚不清楚。近年来许多研究表明，LRIGs基因家族在垂体瘤、神经胶质瘤和皮肤鳞状细胞癌等多种肿瘤中具有抑癌作用。<br>　　LRIG3定位于人类基因组12q13，在人类肿瘤中LRIG3是高表达还是低表达尚不十分清楚，对于其在宫颈癌中表达的相关研究较少，对于其在宫颈癌细胞株中发挥的生物学作用尚未见报道。LRIG3和宫颈癌的发生发展是否有相关性，抑制LRIG3表达对宫颈鳞癌的影响是本研究需要探讨的核心。<br>　　目的:<br>　　检测宫颈鳞癌组织、宫颈上皮内瘤变组织和正常宫颈粘膜组织中LRIG3、EGFR和Ki67的表达，并分析其与宫颈鳞癌浸润转移的关系。观察LRIG3反义核苷酸转染到宫颈癌Hela229细胞中后对LRIG3和EGFR的表达以及对细胞增殖、转移以及细胞周期的影响。观察LRIG3反义核苷酸对宫颈癌裸鼠移植瘤的影响。<br>　　第一部分LRIG3在宫颈鳞癌组织中的表达及意义<br>　　方法:<br>　　应用免疫组织化学和原位杂交检测45例宫颈鳞癌组织、20例CIN组织和30例正常宫颈黏膜组织中LRIG3、EGFR和Ki67表达，并结合临床病理资料对结果进行分析。<br>　　结果:<br>　　1.LRIG3蛋白和mRNA在宫颈鳞状细胞癌组织中的阳性表达率分别为35.56％和48.89％，显著低于CIN组织（分别为70％、80％）和正常宫颈粘膜组织（皆为100％），两两间比较差异均有统计学意义(P＜0.05)。其蛋白和mRNA的表达强度与/和患者的年龄以及肿瘤大小无关（P均＞0.05），而与肿瘤的浸润程度、临床分期以及淋巴结转移成负相关（P均＜0.05）。<br>　　2.EGFR蛋白和mRNA在宫颈鳞状细胞癌组织中的阳性表达率分别为80％和84.44％，显著高于CIN组织（分别为35％、45％）和正常宫颈粘膜组织（分别为6.67％、16.67％），两两间比较差异均有统计学意义(P＜0.05)。在宫颈鳞状细胞癌组织中EGFR蛋白和mRNA的表达强度与患者的年龄、肿瘤大小、临床分期无关（P均＞0.05），而与肿瘤的浸润程度以及淋巴结转移成正相关(P均＜0.05)。<br>　　3.Ki67蛋白和mRNA在宫颈鳞状细胞癌组织中的阳性表达率分别为86.67％和91.11％，显著高于CIN组织（分别为30％和50％）和正常宫颈粘膜组织（分别为3.33％、23.33％），两两间比较差异均有统计学意义(P＜0.05)。Ki-67的表达与宫颈鳞癌各临床病理因素均无相关性((P＞0.05)。<br>　　4.LRIG3和EGFR在宫颈鳞状细胞癌组织中的表达呈负向相关，LRIG3和Ki67在宫颈鳞状细胞癌组织中的表达亦呈负向相关。<br>　　第二部分LRIG3的表达调控对宫颈鳞癌Hela229细胞周期、凋亡、侵袭力的影响<br>　　方法:<br>　　1.设计合成LRIG3反义寡核苷酸(LRIG3ASODN)、正义寡核苷酸序列(LRIG3SODN)以及错义寡核苷酸序列(LRIG3MSODN)，用脂质体Lipofectamine2000包裹转染Hela229细胞，作为转染组细胞。将脂质体转染的细胞作为空白对照组细胞。<br>　　2.Westernblot检测不同浓度(150μg/ml、200μg/ml、250μg/ml)LRIG3ASODN、LRIG3MSODN和LRIG3SODN转染细胞24h、48h及72h后LRIG3和EGFR蛋白表达情况。<br>　　3.RT-PCR检测不同浓度(150μg/ml、200μg/ml、250μg/ml)LRIG3ASODN、LRIG3MSODN和LRIG3SODN转染细胞24h、48h及72h后LRIG3和EGFRmRNA表达情况。<br>　　4.应用MTT检测细胞增殖情况，细胞流式法测定细胞凋亡，细胞基质粘附实验检测细胞粘附能力，Transwell小室法检测细胞的侵袭能力。<br>　　结果:<br>　　1.ASODN组中LRIG3蛋白和mRNA表达较SODN组、MSODN组、空白对照组明显降低(P＜0.05)，且有浓度依赖性和时间依赖性，LRIG3的表达随转染浓度的增加以及时间的延长而减少。<br>　　2.ASODN组中EGFR蛋白和mRNA表达较SODN组、MSODN组、空白对照组明显增加(P＜0.05)，随转染浓度的增加及时间的延长EGFR的表达随之升高。EGFR表达和LRIG3表达呈负相关。<br>　　3.MTT实验表明LRIG3ASODN组Hela229细胞增殖率较其它组别明显升高(P＜0.05)，随着LRIG3ASODN转染浓度增加，表达抑制时间延长，细胞增殖率明显升高，差异有统计学意义(P＜0.05)。<br>　　4.转染LRIG3ASODN后Hela229细胞凋亡率明显降低，随着转染浓度的增加，时间延长，细胞的凋亡率随之降低。<br>　　5.细胞基质粘附实验表明转染LRIG3ASODN后使Hela229细胞粘附率明显增高，随着转染浓度的增加，时间延长，细胞的粘附率随之升高。<br>　　6.Transwell实验表明转染LRIG3ASODN后使得Hela229细胞的迁徙能力明显增高，ASODN组穿膜细胞数(246±10)明显高于SODN组(168±10)、MSODN组（177±8）和空白对照组(176±6)。<br>　　第三部分LRIG3表达调控对人宫颈鳞癌裸鼠移植瘤生长的影响<br>　　方法:<br>　　将1×107个Hela229细胞注射到裸鼠皮下构建宫颈鳞癌裸鼠移植瘤模型，将LRIG3ASODN皮下注射到瘤体内后观察裸鼠移植瘤的生长状态。测量各组种植瘤瘤体体积。Westemblot和RT-PCR检测裸鼠移植瘤中LRIG3和EGFR蛋白和mRNA表达。<br>　　结果:<br>　　1.ASODNLRIG3组注射后18-30天裸鼠细胞瘤体积较其它两组明显增高(P＜0.05)。<br>　　2.Westemblot和PT-PCR检测裸鼠移植瘤中LRIG3蛋白和mRNA表达，显示ASODN组LRIG3表达较MSODN和空白对照组明显降低(P＜0.05)。<br>　　3.Westernblot和PT-PCR检测裸鼠移植瘤中EGFR蛋白和mRNA表达，显示ASODN组EGFR表达较MSODN和空白对照组明显升高(P＜0.05)。<br>　　结论:<br>　　1.宫颈鳞癌组织和CIN组织中LRIG3呈低表达，EGFR高表达，其表达量与宫颈鳞癌的浸润和转移密切相关。提示LRIG3通过对EGFR的负反馈调节起到抑制宫颈鳞癌发生发展的作用。<br>　　2.LRIG3ASODN能显著下调宫颈鳞癌Hela229细胞中LRIG3蛋白和mRNA的表达，同时EGFR蛋白和mRNA表达上升，能抑制宫颈鳞癌细胞凋亡，增强细胞侵袭能力。提示LRIG3在宫颈鳞癌细胞增殖、凋亡及侵袭力中起着重要作用。<br>　　3.LRIG3ASODN可导致宫颈鳞癌裸鼠成瘤速度加快，体积增加，同时移植瘤组织中LRIG3蛋白和mRNA的表达显著降低，EGFR蛋白和mRNA表达增高。