换一批
换一批摘要Pif1家族是一种ATP依赖性的核酸解旋酶，包括酿酒酵母中的ScPif1、裂殖酵母中的SpPfh1、小鼠中的mPif1、人类中的hPif1等成员，能够结合和解旋G4结构、单链和双链DNA、DNA-RNA杂合链等核酸底物，在染色体稳定性、端粒代谢、基因的复制、线粒体的功能、基因的转录等方面具有重要的作用和生理功能。为了通过晶体学的方法研究Pif1家族及其复合物的结构，本研究使用大肠杆菌，克隆和表达了鼠源、酵母、人源等4种Pif1的全长或者截短后的蛋白。通过亲和层析和凝胶过滤层析等方法，纯化得到了mPif11-200，hPif1200-641，SpPfh1305-805，SpPfh1305-790，ScPIF140-859，ScPIF140-859-K264A等6个截短后Pif1蛋白，其中hPif1200-641具有较高的纯度，并且稳定均一，适于结晶。通过EMSA和Ge1 filtration等方法鉴定了hPif1200-641与不同核酸底物的结合效率，选择出最佳的DNA和RNA底物，纯化得到蛋白与核酸的复合物，进行共结晶。经过优化，得到蛋白hPif1200-641及其复合物的棒状单晶。其中hPif1200-641的蛋白晶体X衍射分辨率较高，可以达到3.5(A)，属于P321空间群，晶胞参数为:a=b=204.4(A)，c=77.93(A)，α=90°，β=90°，γ=120°。该研究有助于阐明Pif1结合和解旋DNA和RNA的机制，为接下来的功能学研究奠定了坚实的基础，从而揭示其相关的的生理学功能及分子机理。
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