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大黄素对复苏后综合征中脑保护的实验与临床研究

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摘要研究目的: 　　心脏骤停后综合症(PCAS)是心脏骤停后，机体在非自然状态下（人工心肺复苏）自主循环恢复(ROSC)后出现的一种特殊病理生理状态，病理生理复杂，包括心脏骤停后脑损伤、心肌功能异常、全身性缺血一再灌注损伤和持续诱发性病变，临床治疗效果不甚理想，预后差，病死率高。 　　由于医疗技术水平的不断提高，使得越来越多的院外心脏骤停的病人能得到及时有效的心肺复苏(CPR)，虽然自主血压恢复，但仍有数小时的昏迷，并常伴有数天的多器官功能障碍(MODS)，仅有少数病人神经系统功能恢复良好。心肺复苏成败的关键在于脑复苏，目前国内外对于心脏骤停后脑复苏的防治措施的探索相对缺乏。 　　目前，西药在治疗多器官功能障碍方面有一定疗效，有学者认为大黄素具有脑缺血保护作用，机制与其对缺血后的炎症因子的抑制作用有关，其可降低MIP-3α与IL-6、TNF-α水平。但是大黄素对复苏后综合征中脑保护作用机制的研究，以及大黄素是如何进行炎症因子的抑制，其机理尚未完全阐明。因此，深入了解中药在复苏后脑的保护作用，对心脏骤停综合征有重大的意义。本文主要研究目的为: 　　1.观察PCAS兔模型全身炎症反应综合征及重要脏器器官功能的变化情况。 　　2.探索大黄素对PCAS兔模型重要脏器器官功能及炎性因子的影响。 　　3.探索大黄素对PCAS兔模型脑组织活化蛋白-1(AP-1)与Casepase3表达的影响，以探讨大黄素对脑功能保护作用的机制。 　　4.通过临床试验研究，发现大黄素对心脏骤停病例的心率、炎性因子IL-8、TNF-a、MIP3-alpha、平均动脉压变化和死亡率的影响，说明大黄素在临床治疗上对复苏后综合症具有保护作用。 　　研究方法: 　　30只日本大耳白兔，随机分为假手术组、PCAS模型组和DH（大黄素）治疗组，每组10只。采用气管加闭窒息法致动物心脏骤停，心跳停止5min后，开始心肺复苏，监测动物代谢变化和重要器官功能状态，确认制备心脏骤停后综合征动物模型成功。DH治疗组在造模成功后即以16g/(Kg.d)大黄灌胃治疗，其它组在同时间点以16g/(Kg.d)生理盐水灌胃。 　　兔于复苏前及复苏后0h、6h、24h、48h、72h不同时间点采取静脉血，检测神经元特异性烯醇化酶(NSE)，分别监测脑功能情况。应用酶联免疫吸附试验检测各组血清炎性因子IL-8、肿瘤坏死因子TNF-a、MIP3-alpha水平。 　　72小时后，用空气栓塞法处死兔，立即取兔脑组织，4％多聚甲醛磷酸盐制备石蜡标本，部分置于-80℃保存备用。应用免疫组织化学法检测各组兔脑组织AP-1、Caspase3的表达情况，应用Image-Pro Plus6.0软件分析切片棕色累积光密度值（IOD值），用Mean±SD表示，反映各表达物情况。蛋白质印迹法(Western Blot)测定各组兔脑组织AP-1、Caspase3蛋白表达，采用Tuner法测定各组兔脑组织的细胞凋亡比率。用Alpha软件处理系统分析目标带的光密度值，并比较其差异。 　　在临床上选取50个病例，分为大黄治疗试验组和对照组，分别观察试验组和对照组心率、平均动脉压变化和死亡率的数据情况。 　　研究结果: 　　1、动物行窒息性心脏骤停，心肺复苏成功率为80％，复苏后均有高代谢综合征，存在全身炎症反应综合症和多脏器功能障碍表现，证明PCAS动物模型制备成功。 　　2、大黄素对PCAS兔模型血清NSE的影响 　　大黄素对PCAS兔血清NSE的影响:PCAS模型组反映脑功能的指标NSE在0h、6h、24h、48h、72h时间点分别为0.03±0.37、0.10±0.55、0.13±0.71、0.21±0.25、0.21±1.97（单位:ug/L），说明存在神经元损伤，脑功能受损伤。 　　大黄素治疗后（DH治疗组）NSE在0h、6h、24h、48h、72h时间点分别为0.02±0.37、0.04±0.55、0.05±0.71、0.10±0.25、0.14±1.97(单位:ug/L)，较PCAS模型组明显降低，其中DH治疗组24h、48h时间点NSE水平与PCAS模型组比较，差异有统计学意义(P＜0.05)。 　　由上述结果可见，大黄素能明显改善或减轻多器官功能障碍，防止MODS发展恶化。 　　3、大黄素对PCAS兔模型炎性因子IL-8、肿瘤坏死因子TNF-a、MIP3-alpha的影响 　　3.1大黄素对兔PCAS炎性因子IL-8的影响 　　PCAS模型在心肺复苏后0h、6h、24h、48h、72h时间点血清IL-8水平分别为0.05±0.03、0.06±0.08、0.08±0.07、0.09±0.03、0.12±0.04(单位:ng/L)，反映血清中IL-8水平升高。 　　大黄素治疗后（DH治疗组）0h、6h、24h、48h时间点血清IL-8水平分别为0.07±0.02、0.14±0.03、0.10±0.02、0.05±0.04、0.11±0.03(单位:ng/L)，较PCAS模型组明显降低，其中DH组0h、6h、24h血清IL-8水平与PCAS模型组比较，差异有统计学意义(P＜0.05)。 　　3.2大黄素对兔PCAS炎性因子肿瘤坏死因子TNF-a的影响 　　PCAS模型心肺复苏后0h、h、24h、48h血清肿瘤坏死因子TNF-a水平分别为0.02±0.06、0.05±0.08、0.07±0.11、0.08±0.06、0.10±0.08(单位:ng/L)，反映血清中肿瘤坏死因子TNF-a水平升高。 　　大黄素治疗后（DH治疗组）0h、6h、24h、48h血清肿瘤坏死因子TNF-a水平分别为0.03±0.04、0.06±0.12、0.04±0.04、0.07±0.05、0.08±0.08(单位:ng/L)，较PCAS模型组明显降低，其中DH组0h、6h、24h、48h血清肿瘤坏死因子TNF-a水平与PCAS模型组比较，差异有统计学意义(P＜0.05)。 　　3.3大黄素对兔PCAS炎性因子MIP3-alpha的影响 　　PCAS模型心肺复苏后0h、6h、24h、48h、72h血清MIP3-alpha水平分别为0.02±0.06、0.09±0.08、0.10±0.11、0.07±0.06、0.22±0.08(单位:ng/L)，反映血清中MIP3-alpha水平升高。 　　大黄素治疗后（DH治疗组）0h、6h、24h、48h、72h血清MIP3-alpha水平分别为0.02±0.04、0.03±0.12、0.08±0.04、0.10±0.05、0.18±0.08(单位:ng/L)，较PCAS模型组明显降低，其中DH组0h、6h、24h、48h、72h血清肿瘤坏死因子TNF-a水平与PCAS模型组比较，差异有统计学意义(P＜0.05)。 　　根据上述结果可知，大黄素降低兔PCAS模型血清炎性因子IL-8、肿瘤坏死因子TNF-a、MIP3-alpha水平。 　　4、大黄素对兔PCAS模型脑组织活化蛋白-1（AP-1）和Casepase3的影响 　　4.1免疫组化分析结果 　　4.1.1免疫组化分析AP-1表达 　　假手术组、PCAS模型组、DH治疗组的AP-1表达的光密度值分别为1920.92±60.39、1527.08±84.66和2257.61±315.39。PCAS模型组AP-1表达较假手术组表达增高，差异有统计学意义(P＜0.05)。DH治疗组AP-1表达较PCAS模型组降低，差异有统计学意义(P＜0.01)。DH治疗组AP-1表达较假手术组升高，差异有统计学意义(P＜0.05)。 　　4.1.2免疫组化分析Casepase3表达 　　假手术组、PCAS模型组、DH治疗组的AP-1表达的光密度值分别为1422.08±82.65、2275.61±105.29和2020.92±50.29。PCAS模型组Casepase3表达较假手术组表达高，差异有统计学意义(P＜0.05)。DH治疗组Casepase3表达较PCAS模型组降低，差异有统计学意义(P＜0.01)。DH治疗组Casepase3表达较假手术组高，差异有统计学意义(P＜0.05)。 　　4.2蛋白质印迹法分析结果 　　4.2.1蛋白质印迹法分析AP-1蛋白相对含量以Actin为内参照，检测各组AP-1蛋白相对含量，结果显示假手术组、PCAS模型组、DH治疗组的AP-1表达量分别为0.14±0.03、0.38±0.06、0.25±0.04。PCAS模型组AP-1表达较假手术组高，差异有统计学意义(P＜0.05)。DH治疗组AP-1表达较PCAS模型组降低，差异有统计学意义(P＜0.01)。DH治疗组AP-1表达较假手术组高，差异有统计学意义(P＜0.05)。 　　4.2.2蛋白质印迹法分析Casepase3相对含量 　　假手术组、PCAS模型组、DH治疗组的Casepase3表达量分别为0.23±0.05、0.75±0.040、0.36±0.08。PCAS模型组Casepase3表达较假手术组表达高，差异有统计学意义(P＜0.05)。DH治疗组Casepase3表达较PCAS模型组降低，差异有统计学意义(P＜0.01)。DH治疗组Casepase3表达较假手术组高，差异有统计学意义(P＜0.05) 　　4.3 Tunel法检测脑组织凋亡比率结果 　　假手术组、PCAS模型组、DH治疗组的脑组织凋亡比率分别为0.24±0.03、2.13±0.07、1.00±0.02。PCAS模型组脑组织凋亡较假手术组表达高，差异有统计学意义(P＜0.05)。DH治疗组脑组织凋亡较PCAS模型组降低，差异有统计学意义(P＜0.01)。DH治疗组脑组织凋亡较假手术组高，差异有统计学意义(P＜0.05)。 　　上述结果显示，采用两种方法检测的PCAS模型组的AP-1与Casepase3表达均较假手术组高，DH治疗组的AP-1与Casepase3表达均较PCAS模型组降低。DH治疗组的AP-1与Casepase3表达均比假手术组高。假手术组、PCAS模型组、DH治疗组的脑组织凋亡比率分别为0.24±0.03、2.13±0.07、1.00±0.02。 　　5.通过临床病例实验研究显示，大黄素治疗试验组和对照组的心率、平均动脉压变化基本相近，而试验组的死亡率、炎性因子IL-8、TNF-a、MIP3-alpha较对照组低。 　　研究结论: 　　1.PCAS兔模型存在全身炎症反应综合症和多脏器功能障碍，且持续时间较长，PCAS遵循MODS发生发展的规律。 　　2.大黄素降低兔PCAS模型血清炎性因子IIL-8、肿瘤坏死因子TNF-a、MIP3-alpha水平，减轻脑的损伤，对复苏后脑功能有保护作用。 　　3.PCAS模型组脑组织AP-1、Casepase3表达均较假手术组高，经大黄素治疗后脑组织AP-1、Casepase3表达降低。 　　4.假手术组、PCAS模型组、DH治疗组的脑组织凋亡比率分别为0.24±0.03、2.13±0.07、1.00±0.02。 　　5.通过临床病例实验研究，表明大黄素对复苏后综合症具有保护作用。