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摘要目的:研究体外诱导生成的EpCAM抗原特异性免疫效应细胞对EpCAMhigh腺癌细胞的体外杀伤效率。比较EpCAM抗原特异性免疫效应细胞及EpCAMhigh腺癌细胞全抗原特异性免疫效应细胞对EpCAMhigh腺癌细胞的杀伤效率，并比较EpCAM抗原特异性免疫效应细胞对EpCAMhigh腺癌细胞及EpCAMlow腺癌细胞杀伤效率。<br>　　方法:体外培养多种腺癌细胞株，流式法检测各种细胞株表面EpCAM的表达量，分别选择EpCAM高表达的(EpCAMhigh)LS174-T结肠腺癌细胞及EpCAM低表达(EpCAMlow)的PaCa-2胰腺癌细胞作为靶细胞。采集健康成人外周血，经梯度密度离心法收集单个核细胞(PBMCs)，贴壁法分离淋巴细胞及imDCs。体外诱导淋巴细胞中T细胞转化为CIK细胞并扩增[2]。以LS174-T细胞裂解物负载imDCs促进其成熟，生成LS174-T腺癌细胞裂解物-mDCs(LS-mDCs)，LS-mDCs与自体CIK细胞进行体外共培养，向CIK细胞提呈LS174-T肿瘤全抗原信息，部分CIK细胞转化为具有LS174-T全抗原特异性杀伤活性的CTL，从而制备LS174-T腺癌细胞全抗原特异性DC-CIK-CTL效应细胞(LS-effector)。相似的方法，以纯化EpCAM多肽抗原负载imDCs促进其成熟，生成EpCAM-mDCs(Ep-mDCs)，Ep-mDCs与自体CIK细胞体外共培养，向CIK细胞提呈EpCAM抗原信息，部分CIK转化为具有EpCAM特异性杀伤活性的CTL，从而制备成纯化EpCAM抗原特异性DC-CIK-CTL效应细胞（Ep-effector）。流式细胞术（Flow CytoMetry，FCM）分别检测imDCs、LS-mDCs及Ep-mDCs表面CD80、CD86、CD83、HLA-DR的表达量，对其差异进行统计学分析。设单纯CIK组、LS-effector组及Ep-effector组，流式法分别检测day0、day7、day14(d0、d7、d14)单纯CIK组中CD3+CD8+T细胞及CD3+CD56+细胞比例变化，LS-effector组及Ep-effector组中CD3+CD8+T细胞及CD3+CD4+T细胞比例变化，CD3+CD4+T/CD3+CD8+T比值变化，分别对其差异进行统计学分析。细胞毒试验（CCK-8法）检测不同效靶比时各组效应细胞对 EpCAMhigh的LS174-T及EpCAMlow的PaCa-2的杀伤效率，对其差异进行统计学分析。<br>　　结果:<br>　　1 LS174-T细胞EpCAM表达量为99.95％，PaCa-2细胞EpCAM表达量为6.70％。<br>　　2 LS-mDCs及Ep-mDCs表面CD80、CD86、CD83、HLA-DR的表达量均较未负载抗原的imDCs明显增多，差异均具有统计学意义(P＜0.05)，LS-mDCs及Ep-mDCs表面CD80、CD86、CD83、HLA-DR的表达量无统计学差异（P＞0.05）。<br>　　3体外培养d0、d7、d14后各组效应细胞表型发生变化。d14单纯CIK组中CD3+CD8+T细胞比例为80.47±1.38％，高于d0的CD3+CD8+T细胞比例25.10±0.53％（P＜0.05），CD3+CD56+细胞比例为13.37±0.61％,高于d0的CD3+CD56+T细胞比例为5.73±0.68％(P＜0.05)。LS-effector组中CD3+CD8+T细胞比例为76.60±2.96％, Ep-effector组中CD3+CD8+T细胞比例为81.80±2.63％，均高于d0的CD3+CD8+T细胞比例为25.10±0.53％(P＜0.05，P＜0.05)，LS-effector组中CD3+CD4+T细胞比例为23.33±1.80％，Ep-effector组中CD3+CD4+T细胞比例为25.77±1.50％，均低于d0的CD3+CD4+T细胞比例为30.07±0.85％(P＜0.05，P＜0.05)。LS-effector组中CD3+CD4+T/CD3+CD8+T比值为0.30±0.03，Ep-effector组中CD3+CD4+T/CD3+CD8+T比值为0.30±0.01，均低于d0的CD3+CD4+T/CD3+CD8+T比值为1.20±0.02(P＜0.05，P＜0.05)。<br>　　4随效靶比(E∶T)增高，各组效应细胞的杀伤效率均升高。单纯CIK组对LS174-T的杀伤效率E∶T=5∶1时为39.59±9.37％，E∶T=10∶1时为49.48±11.71％，E∶T=20∶1时为69.39±6.65％，E∶T=20∶1时单纯CIK组对LS174-T的杀伤效率高于E∶T=5∶1(P＜0.05)。单纯CIK组对PaCa-2的杀伤效率E∶T=5∶1时为37.68±6.09％，E∶T=10∶1时为47.10±7.61％，E∶T=20∶1时为66.33±10.04％。E∶T=20∶1时单纯CIK组对PaCa-2的杀伤效率高于E∶T=5∶1(P＜0.05)。LS-effector组对LS174-T的杀伤效率E∶T=5∶1时为53.01±6.91％，E∶T=10∶1时为66.26±8.64％，E∶T=20∶1时为74.71±8.36％，E∶T=20∶1时LS-effector组对LS174-T的杀伤效率高于E∶T=5∶1(P＜0.05)。LS-effector组对PaCa-2的杀伤效率E∶T=5∶1时为41.99±6.87％，E∶T=10∶1时为52.48±8.58％，E∶T=20∶1时为65.56±8.62％，E∶T=20∶1时LS-effector组对PaCa-2的杀伤效率高于E∶T=5∶1(P＜0.05)。Ep-effector组对LS174-T的杀伤效率E∶T=5∶1时为63.34±1.85％，E∶T=10∶1时为71.07±8.48％，E∶T=20∶1时为93.57±5.68％，E∶T=20∶1时Ep-effector组对LS174-T的杀伤效率高于E∶T=5∶1(P＜0.05)。Ep-effector组对PaCa-2的杀伤效率E∶T=5∶1时为43.40±5.65％，E∶T=10∶1时为59.42±5.67％，E∶T=20∶1时为78.37±9.63％, E∶T=20∶1时Ep-effector组对PaCa-2的杀伤效率高于E∶T=5∶1（P＜0.05）。<br>　　5 E∶T=20∶1时，比较各组效应细胞对LS174-T及PaCa-2杀伤效率的差异。单纯CIK组对LS174-T的杀伤效率为69.39±6.65％，对PaCa-2的杀伤效率为66.33±10.04％，两者比较无统计学差异(P＞0.05)，LS-effector组对LS174-T的杀伤效率为74.71±8.36％，对PaCa-2的杀伤效率为65.56±8.62％比较，两者比较无统计学差异(P＞0.05)。Ep-effector组对LS174-T的杀伤效率为93.57±5.68％，高于对PaCa-2的杀伤效率78.37±9.63％(P＜0.05)。<br>　　6 E∶T=20∶1时，比较各效应细胞组间对LS174-T及PaCa-2杀伤效率的差异。单纯CIK组对LS174-T的杀伤效率为69.39±6.65％，LS-effector组对LS174-T的杀伤效率为74.71±8.36％，Ep-effector组对LS174-T的杀伤效率为93.57±5.68％，组间整体杀伤效率具有统计学差异(P＜0.05)，Ep-effector组高于LS-effector组（P＜0.05），Ep-effector组高于单纯CIK组(P＜0.05)，LS-effector组与单纯CIK组无统计学差异(P＞0.05)。单纯CIK组对PaCa-2的杀伤效率为66.33±10.04％, LS-effector组对PaCa-2的杀伤效率为65.56±8.62％，Ep-effector组对PaCa-2的杀伤效率为78.37±9.63％，两两组间比较无统计学差异(P＞0.05)。<br>　　结论:<br>　　1 EpCAM抗原表达于多种腺癌细胞表面，但表达量高低不等，在LS174-T细胞中的表达量高达99.95％，EpCAM可能成为LS174-T腺癌细胞的免疫治疗靶点。<br>　　2 EpCAM抗原及LS174-T细胞裂解物负载imDCs均能够促其成熟，Ep-mDCs与LS-mDCs均具有抗原提呈能力，分别将EpCAM抗原信息及LS174-T细胞全抗原信息提呈给自体CIK细胞，分别促使其向具有EpCAM特异性及LS174-T细胞全抗原特异性杀伤功能的CTL细胞转化。<br>　　3 PBMCs中的T淋巴细胞在体外培养条件下能够诱导生成具有免疫杀伤活性的CIK细胞，LS-mDCs及Ep-mDCs均能够激活自体CIK细胞产生具有高效免疫杀伤功能的LS-effector及Ep-effector。<br>　　4单纯CIK、LS-effector及Ep-effector对LS174-T细胞均具有高效杀伤活性，随E∶T比值升高，各组杀伤效率均升高，Ep-effector组杀伤效率高于LS-effector组及单纯CIK组。单纯CIK组对LS174-T及PaCa-2的杀伤效率相同，Ep-effector对LS174-T的杀伤效率高于对PaCa-2的杀伤效率，表明Ep-effector对EpCAM具有更高的特异性杀伤活性。