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摘要目的:原发性肝癌是世界第五大恶性肿瘤，在癌症相关死亡原因中排名第三。目前，临床上常用的治疗原发性肝癌的方法有射频消融治疗、肝动脉栓塞化疗、无水乙醇注射治疗、放疗等，但疗效欠佳，这很大程度上归因于肝癌的异质性。放疗是恶性肿瘤治疗的主要手段之一，如何提高肝癌的辐射敏感性是提高肝癌放疗疗效的关键。因此人们一直致力于寻找肝癌的辐射敏感基因。IER5基因属于慢动力基因组，电离辐射可诱导多种肿瘤细胞IER5表达上调，我们的前期研究结果显示:抑制IER5表达能促进肝癌HepG2细胞及宫颈癌Hela细胞增殖，增强其抗辐射能力，降低其辐射敏感性;增加IER5表达能抑制HepG2和Hela细胞生长、增殖与分裂，促进细胞凋亡，削弱其抗辐射能力，增强其辐射敏感性。说明IER5基因在肝癌、宫颈癌等恶性肿瘤发生中发挥一定作用，IER5基因参与了肝癌及宫颈癌辐射敏感性的调节，作用类似于p53等抑癌基因。细胞周期(cell cycle)，是指能持续分裂的真核细胞从一次有丝分裂结束后生长，再到下一次分裂结束的循环过程。癌变的细胞以及特定阶段的胚胎细胞常常有异常的分裂周期。Cdc25磷酸酶是一种双特异磷酸酶，是细胞周期的重要调控元件。Cdc25磷酸酶有三个亚型:Cdc25A，Cdc25B和Cdc25C。研究发现在多种肿瘤组织中Cdc25B表达增加，多数研究认为Cdc25B过表达促进了肿瘤的发生。Cdc25B启动子分析显示p53通过与Cdc25B的启动子相结合抑制Cdc25B表达，从而抑制了肿瘤的发生。目前国外研究发现在急性淋巴细胞白血病细胞中IER5通过与Cdc25B启动子相结合来抑制其表达，从而抑制肿瘤细胞的增殖。IER5在肝癌HepG2细胞中是否也通过与Cdc25B启动子相结合来发挥其抑癌基因的作用，目前国内外未见报道，本研究以HepG2细胞为研究对象，采用RT-PCR、半定量PCR、瞬时转染、染色质免疫共沉淀、荧光素酶报告基因等方法研究IER5与Cdc25B间的相互作用。进一步探讨IER5基因在肝癌发生发展中的作用及作用机制，期望为肝癌的分子靶向治疗提供新的靶点。<br>　　方法:1采用实时定量PCR方法检测4Gy Co60γ射线照射后HepG2细胞IER5及Cdc25B mRNA表达的时间效应关系。2采用瞬时转染技术降低HepG2细胞IER5表达，采用半定量PCR方法检测Cdc25B mRNA含量，研究抑制IER5表达对4Gy Co60γ射线照射后Cdc25B mRNA表达的影响。3采用染色质免疫共沉淀方法分别于4Gy Co60γ射线照射后0、2、4、6、8h，检测HepG2细胞IER5蛋白与Cdc25B启动子结合的变化。4构建Cdc25B启动子重组质粒，采用荧光素酶报告基因技术分析4Gy Co60γ射线照射后IER5对HepG2细胞Cdc25B启动子转录活性的影响。<br>　　结果:<br>　　1、辐射后HepG2细胞IER5和Cdc25B mRNA表达的变化:4Gy Co60γ射线照射后0、1、2、4、8、12h检测HepG2细胞IER5及Cdc25B mRNA的含量，结果显示:IER5 mRNA于照射后2h较未照射时(0h)明显增加，同时Cdc25B mRNA表达开始下降，照射后4h Cdc25B mRNA明显低于未照射时，两者间呈相反的变化趋势，提示IER5可能存在抑制Cdc25B表达的作用。<br>　　2、抑制IER5表达对辐射调控Cdc25B mRNA表达的影响:4Gy Co60γ射线照射后，与对照HepG2细胞相比，IER5低表达细胞Cdc25B mRNA含量无明显下降，说明抑制IER5表达削弱了辐射对Cdc25B表达的抑制作用，提示辐射可能通过增加IER5的表达来抑制Cdc25B的表达，发挥抗肿瘤作用。<br>　　3、辐射后HepG2细胞IER5蛋白与Cdc25B启动子间的作用:4Gy Co60γ射线照射HepG2细胞后0、2、4、6、8h收集细胞，采用交联染色质免疫共沉淀技术检测IER5蛋白与Cdc25B启动子结合的变化。结果显示:辐射后4h IER5蛋白与Cdc25B启动子结合显著性增多，且随着IER5表达增加二者结合进一步增多，说明IER5通过竞争性结合Cdc25B启动子发挥抑制Cdc25B表达的作用。<br>　　4、辐射后抑制IER5表达对Cdc25B启动子活性的影响:应用荧光素酶报告基因方法，构建Cdc25B启动子重组质粒，分别包含靶启动子片段(-911,+105)、(-575,+105)、(-227,+105)、(-122,+105)和(-51，+105)。将五种不同的Cdc25B启动子重组质粒与shIER5质粒或空载质粒共同转染HepG2细胞，IER5低表达细胞（转染shIER5质粒）为实验组，转染空载质粒者为对照组，4Gy Co60γ射线照射后检测荧光素酶活性。结果显示:照射前，分别转染(-911，+105)、(-575，+105)、（-227，+105）、(-122，+105)四种启动子片段的实验组较对照组Cdc25B启动子转录活性明显增加，而转染（-51，+105）片段的实验组与对照组间启动子活性无明显差异，说明抑制IER5表达增加了Cdc25B启动子的转录活性，且(-51，+105)片段中未包含IER5的作用位点，其作用位点可能在(-122，-51);照射后，分别转染五种不同启动子重组质粒的实验组与对照组间Cdc25B启动子转录活性的无明显差异，提示辐射上调IER5表达后，实验组与对照组启动子转录活性的差异消失，再次说明IER5对Cdc25B启动子的转录活性有抑制作用。<br>　　结论:辐射诱导HepG2细胞IER5表达增加，IER5可能通过竞争性结合Cdc25B启动子，抑制Cdc25B启动子转录活性，下调Cdc25B表达，从而发挥其抑癌基因的作用。这一机制的发现有望为肝癌的分子靶向治疗提供新的靶点。