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摘要研究目的<br>　　原发性肝细胞癌(Hepatocellularcarcinoma，HCC)是我国发生率较高的恶性肿瘤之一，由于其早期症状不典型，患者出现临床症状时大多已处于中晚期，且术后易复发转移，预后差，死亡率高。因此，探讨HCC发生发展的分子生物学机制，寻找起关键调控作用的分子靶点，研究特异的肿瘤诊断标志物或治疗靶分子已成为当前的研究热点。细菌鞭毛蛋白(Flagellin，FliC)是TLR5的特异性配体，研究证实，纯化的鞭毛蛋白以及表达鞭毛蛋白的细菌（沙门氏菌）对结肠癌和胰腺癌肝转移小鼠模型均显示出良好的抗肿瘤效果。<br>　　恶性增生性疾病的发生、发展一般均与细胞周期调控机制紊乱有关。细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)在细胞周期调控中起关键作用，因此抑制其催化活性可以对肿瘤的治疗起到积极作用。弗拉平度flavopiridol(FLA)是美国第一个进入临床试验的CDKs抑制剂，主要通过抑制CDK1、CDK2和CDK4激酶活性抑制细胞增殖。然而，临床研究数据显示，单独使用此类药物并不能达到理想的治疗效果，与现有的化疗药物的联合使用则展现出良好的治疗前景。<br>　　放射性核素显像可从分子水平上实时、无创地监测疾病的发生发展，从而在疾病的早期提供功能代谢方面改变的信息。本研究选择TLR5为分子靶点，观察不同浓度的FliC与FLA对H22肝癌细胞株增殖与凋亡的影响，并以放射性核素131I作为TLR5靶向向诊断的“弹头”，连接TLR5单克隆抗体，应用131I-anti-TLR5McAb对肝癌荷瘤小鼠进行移植瘤显像和体内生物学分布研究，为肝癌的早期诊断及体内放射免疫治疗探讨新的靶向制剂。<br>　　研究方法<br>　　1、逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)及免疫组化法检测TLR5的表达。<br>　　2、细胞增殖毒性实验(CellCountingKit-8，CCK-8)检测基因重组鞭毛蛋白(rFliC，recombinantflagellin)及FLA不同给药方案对H22细胞的生长抑制作用。<br>　　3、AnnexinV-FITC/PI染色法流式细胞仪分析rFliC及FLA不同给药方案对H22细胞凋亡的影响。<br>　　4、取对数生长期的H22细胞，皮下接种于BALB/c小鼠，建立荷瘤鼠模型。<br>　　5、采用四氯二苯基苷脲(Iodogen)放射性碘化标记法合成131I-anti-TLR5McAb，经SephadexG-25柱分离纯化，纸层析检测其标记率和放射化学纯度。<br>　　6、检测131I-anti-TLR5McAb的体外稳定性。<br>　　7、研究H22细胞体外对131I-anti-TLR5McAb的摄取情况。<br>　　8、对H22细胞进行131I-anti-TLR5McAb体外受体结合分析。<br>　　9、注射131I-anti-TLR5McAb后的不同时间后对荷瘤鼠分别进行放射自显影显像和体内生物学分布实验。<br>　　实验结果<br>　　1、RT-PCR和免疫组化结果表明TLR5的mRNA和蛋白在H22移植瘤部位均高表达。<br>　　2、CCK-8结果显示，rFliC与FLA单用或联合应用均可明显抑制H22细胞的增殖，并呈浓度相关性;联合应用抑制作用明显增强，与单独用药组比较，差异有统计学意义(P＜0.05)。<br>　　3、流式细胞术分析显示rFliC、FLA单独作用，均能诱导H22细胞凋亡;联合应用时诱导凋亡作用显著增强(P＜0.01)。<br>　　4、成功制备肝癌H22荷瘤小鼠模型。<br>　　5、用Iodogen法进行放射性碘标记anti-TLR5McAb，制备方法简便迅速，标记率高，放射化学性质稳定，标记率达95.19％，纸层析法测得放化纯为96.46％，体外稳定性高。<br>　　6、细胞体外摄取实验显示:经过6、12、24、48h孵育后，H22细胞对131I-anti-TLR5McAb的摄取率均明显高于对照组Na131I的摄取率(P＜0.05)。<br>　　7、细胞受体结合实验测得H22细胞的亲和力Kd值为（2.81±0.05）nmol/L，最大结合位点Bmax值为(4.65±0.09)μmol/L。<br>　　8、体内生物学分布实验显示131I-anti-TLR5McAb主要通过肝、肾代谢，其他器官放射性较低，肿瘤部位的放射性摄取明显高于正常肝脏组织。实验组在注射6h时％ID/g为(6.51±0.63)，12h时达高峰，为(8.03±0.42)，而对照组摄取高峰时的％ID/g较低，仅为(3.83±0.26)。<br>　　9、磷屏放射自显影图像显示，实验组在注射131I-anti-TLR5McAb后24h即可获得清晰放射自显影图像，荷瘤鼠的移植瘤部位放射性浓聚明显，肿瘤靶向性良好。<br>　　研究结论<br>　　TLR5在肝癌细胞株H22中高表达，TLR5激动剂-鞭毛蛋白可以明显抑制H22细胞的增殖、促进凋亡，并呈浓度依赖方式。研究结果为以TLR5为靶点进行肝癌治疗奠定了实验基础。放射性碘化标记的131I-anti-TLR5McAb制备简便、生物学性质稳定，标记率高，在肝癌荷瘤小鼠中肿瘤靶向性分布明显，且在靶组织中清除缓慢，放射自显影图像质量好，可作为一种新型分子探针监测肝癌的发生发展，并有望用于其他TLR5表达阳性的肿瘤显像。