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摘要前言:<br>　　肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是最常见的消化道恶性肿瘤之一，位居全球癌症相关性死因的第三位，特别是在发展中国家。HCC的发生是多基因多步骤的过程，涉及许多增殖、凋亡相关基因的改变。HCC与潜在的血管侵袭、转移相关，多数HCC患者诊断时已处于晚期失去了手术的机会，导致HCC的五年生存率较低、预后较差。因此，对肝细胞肝癌的早期诊断及治疗提出了迫切的要求。<br>　　磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3（Glypican-3，GPC3）是一种新的肝细胞肝癌肿瘤标志物，对肝癌的诊断及治疗具有重要意义，是硫酸乙酰肝素蛋白聚糖家族的一员，由胎儿肝脏产生，在胚胎发育期调节细胞的增殖及存活。GPC3基因在HCC发生过程中可能通过参与不同的信号转导通路而调节细胞的增殖、凋亡、侵袭粘附及分化能力。GPC3基因在HCC中特异性高表达而在正常组织及癌旁组织中几乎不表达或低表达的特性使其成为HCC新的肿瘤标志物及潜在基因治疗靶点。<br>　　慢病毒载体介导的RNA干扰(RNA interference，RNAi)就是将慢病毒载体高效感染和整合的特性与RNA干扰特异性抑制同源基因表达的作用相结合。慢病毒载体解决了RNAi容易被降解，性质不稳定，细胞摄取率不高及在细胞内表达的安全性等问题。<br>　　本研究拟通过应用慢病毒载体介导的RNA干扰技术，使肝癌细胞中GPC3基因的表达下调，观察沉默GPC3基因对肝癌细胞增殖、凋亡、侵袭、迁移能力的影响，进而探索GPC3基因在肝癌的发生发展中所起的作用。<br>　　材料与方法:<br>　　一、实验材料<br>　　细胞株:肝癌HepG2细胞株购自中国科学院上海生命科学研究院细胞库。293T细胞株由本室保存。<br>　　二、研究方法<br>　　1、构建沉默GPC3基因的慢病毒载体，并稳定转染肝癌HepG2细胞。<br>　　2、应用RT-PCR，Western blot分别从mRNA和蛋白水平检测转染前后GPC3基因在肝癌细胞中表达情况的变化。<br>　　3、细胞增殖实验检测转染后肝癌细胞的增殖能力的变化。<br>　　4、流式细胞术检测转染后肝癌细胞凋亡能力的变化。<br>　　5、Transwell侵袭小室、细胞划痕实验检测转染后肝癌细胞的侵袭迁移能力的变化。<br>　　6、统计学处理:实验至少重复3次，采用SPSS17.0软件对数据进行统计分析，数据结果以(x)±s表示，以P＜0.05为判断差异显著性标准。<br>　　结果:<br>　　1、经酶切鉴定，测序结果表明GPC3-shRNA慢病毒载体构建正确，并测定滴度为1×108TU/ml。最适感染复数(MOI)为10，最佳感染时间为72h。<br>　　2、转染后，转染组GPC3基因的mRNA及蛋白表达较阴性对照组及空白对照组下调。<br>　　3、沉默GPC3基因的转染组较阴性对照组及空白对照组相比，增殖能力下降。<br>　　4、转染后，肝癌细胞的凋亡细胞数较阴性对照组及空白对照组增加。<br>　　5、转染后经过48h的培养，肝癌细胞穿过matrigel胶的细胞数较阴性对照组及空白对照组相比减少，迁移的速度较阴性对照组及空白对照组减慢。<br>　　结论:<br>　　1、成功构建了GPC3-shRNA慢病毒载体。<br>　　2、慢病毒载体介导的RNA干扰，能稳定的转染肝癌细胞，并在mRNA及蛋白水平下调肝癌细胞中GPC3基因的表达。<br>　　3、沉默肝癌细胞中的GPC3基因的表达，可抑制肝癌细胞的增殖，诱导肝癌细胞的凋亡，降低肝癌细胞对matrigel胶的粘附能力，降低其侵袭迁移能力。<br>　　4、GPC3基因在肝细胞肝癌中起促进肿瘤发展的作用，是肝细胞肝癌新的肿瘤标志物及可能基因治疗靶点。