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摘要目的:<br>　　1、巢式实时荧光定量聚合酶连反应(Quantitative Nested Real-Time Polymerase Chain Reaction，QNRT-PCR)检测结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB) DNA方法的建立。<br>　　2、评价QNRT-PCR检测MTB DNA的应用及其在结核性胸膜炎诊断中的价值。<br>　　方法:<br>　　1、制备结核分枝杆菌MPT64基因荧光定量标准品<br>　　以H37vRV标准菌株MPT64基因为模板，在引物（IF-1和IR-2，具体序列详见第一部分第一节引物的设计合成）引导下进行PCR扩增，对PCR产物割胶回收、纯化后与pGM-T载体连接，经过克隆、转化、筛选及测序鉴定，确定目的质粒，根据公式:质粒拷贝数浓度（拷贝/ml）=（质量÷分子量）×6.02×1023，利用紫外分光光度计计算出质粒拷贝浓度，10倍倍比稀释后作为检测MTB DNA的阳性参照定量标准品。<br>　　2、建立巢式PCR(nested PCR，nPCR)检测结核分枝杆菌DNA的方法<br>　　根据MTB基因的稳定性和特异性，设计扩增MPT64基因序列的内外套引物（外套引物分别为EF-1、ER-2，内套引物分别为IF-1、IR-2，具体序列详见第一部分第一节引物的设计合成），应用nPCR两步法，分别扩增DNA片段大小为241bp和201bp的内外片段，2％的琼脂糖凝胶电泳，然后采用核酸蛋白成像仪拍照对图片进行定性分析。<br>　　3、建立实时定量PCR(Real-time PCR)检测结核分枝杆菌DNA的方法<br>　　以IF-1和IR-2为引物，结核分枝杆菌MPT64基因序列为模板，以上述“1”构建的质粒标准品为阳性参照，采用SYBR GreenⅠ荧光染料法对PCR扩增过程进行标记，LightCyler3.5 real-time PCR system进行数据检测分析，目的片段为201bp。<br>　　4、建立QNRT-PCR检测MTB DNA方法<br>　　胸水是一种含结核分枝杆菌微量的样本，为了提高PCR检测这类样本中MTB DNA的敏感性和特异性，同时能够准确定量，我们将nPCR和real-time PCR两种方法进行合并创新，在巢式PCR第二步应用SYBRGreenⅠ荧光染料法，以上述“1”构建的质粒标准品为阳性参照，建立检测结核分枝杆菌MPT64基因的QNRT-PCR方法。<br>　　5、比较三种PCR检测痰液和胸水中MTB DNA的结果<br>　　我们将来自肺结核患者痰液24份，结核性胸膜炎患者胸水27份，以及对照组75份痰和胸水同时进行了上述三种PCR方法的检测和比较。<br>　　6、分别对27例结核性胸膜炎患者的炎性指标、免疫指标、胸水量等与巢式实时荧光定量PCR结果及五种病原学检测方法之间进行了相关性分析法<br>　　结果:<br>　　1、成功构建质粒标准品，用测定的重组质粒序列与GeneBank中的MTB标准菌株H37Rv的MPT64基因序列进行比较，同源性100％。将7.09×1012拷贝/ml质粒倍比稀释后取7.09×102-7.09×109copy/ul的8个梯度，得到该方法在104-108拷贝/ml范围内，随着起始模板量的减少，对应的Ct值相应增大，二者呈线性关系，r=0.99，且溶解曲线呈单峰。<br>　　2、以痰培养结核分枝杆菌阳性为肺结核确诊标准，检测24份来自肺结核病人的痰MTB DNA，结果巢式实时荧光定量PCR方法的敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值分别为95.83％、61.54％、69.70％、和94.12％;以内科胸腔镜胸膜活检的组织病理学结果为金标准，其敏感性和特异性分别为75％和100％; QNRT-PCR、real-time PCR、nPCR三种方法检测结果比较阳性率差异显著(P＜0.05)，QNRT-PCR的敏感性最高;两种定量PCR检测结果比较，QNRT-PCR的Ct值较小。<br>　　3、进一步将QNRT-PCR用于胸水中MTB DNA的检测，结果，对来自结核性胸膜炎患者的27份胸水样本中，该方法阳性率70.37％，而real-time PCR及nPCR的阳性率分别为66.67％及11.11％。<br>　　4、通过对QNRT-PCR方法检测结核性胸膜炎患者胸水样本中MTBDNA量与其他指标的相关性分析得出:胸水中MTB DNA量与ESR、AFB、培养、nPCR、T-SPOT、PPD指标具有正相关，且差异有统计学意义，与其他指标无明显正相关。<br>　　结论:<br>　　1、本研究建立了QNRT-PCR检测MTB DNA方法，并证实该方法具有很高的敏感性，且特异性较好;<br>　　2、通过对三种PCR方法检测胸水MTB DNA结果比较，可见QNRT-PCR方法对胸水样本中MTB DNA样本的高敏感性并准确定量，在结核性胸膜炎诊断中具有很好的临床应用价值。