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摘要红曲霉（Monascus）是一种丝状真菌，属散囊菌目，红曲菌科，红曲霉属。工业上，红曲霉作为一种重要的微生物资源，用来生产色素以及γ-氨基丁酸(γ-AminobutyricAcidor4-Aminobutyrate，GABA)等其他有用化合物。GABA属于非蛋白氨基酸，存在于哺乳动物的脑部，是一种重要的抑制性神经递质，对于头痛、耳鸣以及由中风和脑动脉硬化引起的健忘症等具有一定的疗效，还可以增加供氧量，加速脑细胞代谢。在红曲霉中，GABA代谢主要涉及到两种重要的酶，即谷氨酸脱羧酶（Glutamatedecarboxylase，GAD）和GABA转氨酶(4-Aminobutyrateaminotransferase，GABA-T)。GAD催化谷氨酸生成GABA，GABA-T催化GABA生成琥珀酸半醛(succinicsemialdehyde，SSA)。近年来，有众多研究报道了通过红曲霉的菌种选育和发酵条件优化来提高GABA的产量，但是从分子水平调控GABA的生产却鲜见报道，而关于GABA代谢相关的酶GAD和GABA-T的基因序列更是无从查询。<br>　　本研究以实验室筛选保存的红色红曲霉Mr-5菌株(CGMCCNO.M208043)为实验材料，提取了红曲霉总RNA，合成了cDNA;通过比对几种曲霉属（Aspergillus)物种的GAD和GABA-T基因序列，根据保守区设计了简并引物;利用RACE技术和TouchdownPCR技术扩增获得了红色红曲霉GAD和GABA-T基因的序列;采用在线分析及相应软件分析预测了GAD和GABA-T的组成、理化性质、信号肽以及高级结构等;利用实时荧光定量PCR技术分析了GAD和GABA-T基因的相对表达情况;对GAD基因进行了原核表达，分离纯化后得到了目的蛋白。主要结果如下:<br>　　1.红色红曲霉Mr-5GAD的基因序列<br>　　红色红曲霉的Mr-5GAD基因全长cDNA序列全长为1784bp，包含一个1536bp的编码GAD基因的开发阅读框(ORF)，还有152bp的5'-UTR序列和96bp的3'-UTR序列。红色红曲霉GAD基因的核苷酸序列与黑曲霉(Aspergillusniger)的相似性为80％，与新萨托菌（Neosartoryafischeri）和棒曲霉（Aspergillusclavatus）的相似性都为79％。<br>　　2.红色红曲霉Mr-5GAD的生物信息学分析<br>　　红色红曲霉Mr-5GAD基因序列全长1536bp，起始密码子为ATG,终止密码子为TAA，编码511个氨基酸，其中67个氨基酸带负电荷，59氨基酸个带正电荷;理论分子量和等电点(PI)分别为57789.7Da和6.05，分子式为C2562H4004N704O768826;脂溶指数为82.41，疏水指数为-0.330，属于亲水性蛋白;二级结构中α-螺旋比例为54.41％，延伸链比例为30.72％，β-转角占7.24％，无规卷曲占7.63％;三级结构模型显示与该GAD蛋白含有大量的α-螺旋和β-折叠，与二级结构的预测结果相符。保守结构域检测结果显示该序列有GAD功能位点，催化位点的氨基酸是赖氨酸(Lys，K)，结合位点由8个氨基酸构成。构建的系统进化树显示红色红曲霉的GAD与烟曲霉（Aspergillusfumigatus）等几种曲霉的GAD在进化关系上最为接近。Blastp结果显示其与烟曲霉（A.fumigatus）和新萨托菌（N.fischeri）的GAD氨基酸序列同源性最高，都为84％。<br>　　3.红色红曲霉Mr-5GABA-T的基因序列<br>　　红色红曲霉Mr-5GABA-T的基因序列全长1563bp。Blastn比对结果显示该基因的核苷酸序列与棒曲霉(A.clavatus，登录号XM_001274002.1)、黑曲霉(A.niger，登录号XM_001398283.2)和土曲霉(Aspergillus.terreus，登录号XM_001217976.1)的相似性都为82％，与烟曲霉（A.fumigatus，登录号XM748872.1）的相似性为81％。<br>　　4.红色红曲霉Mr-5GABA-T的生物信息学分析<br>　　红色红曲霉Mr-5GABA-T基因序列全长1563bp，起始密码子为ATG，终止密码子为TAA，编码520个氨基酸，其中49个氨基酸带负电荷，56氨基酸个带正电荷;理论分子量和等电点(PI)分别为57534.9Da和9.12，分子式为C2595H4063N715O740S13;脂溶指数为87.50，疏水指数为-0.216，属于亲水性蛋白;二级结构中α-螺旋比例为47.12％，延伸链比例为31.15％，β-转角占9.04％，无规卷曲占12.69％;三级结构模型显示与该GAD蛋白含有大量的α-螺旋和β-折叠，与二级结构的预测结果相符。保守结构域检测结果显示该序列有GABA-T功能位点，催化位点的氨基酸是赖氨酸(Lys，K)，结合位点由8个氨基酸构成。系统进化树显示该GABA-T与曲霉属（Aspergillus）的GABA-T在进化关系上最为接近。Blastp结果显示其与土曲霉(A.terreus，登录号:XP_001217977.1)和米曲霉(Aspergillusoryzae，登录号:EIT80762.1)的GABA-T氨基酸序列同源性最高，都为82％。<br>　　5.GAD和GABA-T基因的表达分析<br>　　利用qRT-PCR技术检测了不同培养时间下红色红曲霉Mr-5的GAD和GABA-T基因的相对表达情况。通过内参基因actin的转录水平将GAD和GABA-T基因转录的mRNA量进行标准化，并以第一组(10d)为对照进行分析。结果显示，红色红曲霉GAD的mRNA水平随着培养时间的延长而增高，培养16d、19d和22d的相对表达量与对照组差异显著(p＜0.05);GABA-T的相对表达量随着培养时间的延长而降低，在培养时间为19d的时候接近最低值，其他各组与对照组(10d)的差异显著(P＜0.05)。<br>　　6.红色红曲霉Mr-5GAD基因的原核表达<br>　　将红色红曲霉Mr-5的GAD基因与载体pET-21a(+)连接，转化到E.coliBL21(DE3)中进行诱导表达。SDS-PAGE结果显示，IPTG浓度为1mM，在37℃、28℃、16℃的诱导条件下，重组蛋白主要以包涵体形式表达，且在28℃下表达量最大，其相对分子质量约为58kDa，与预测值相符。重组蛋白经镍离子亲和层析纯化，SDS-PAGE结果表明咪唑浓度为250mM时洗脱效果最好，经纯化后的融合蛋白只有一条蛋白带，Bradford法测得纯化后的蛋白浓度为0.2956mg/mL。