摘要目的:证明rPEDF(Recombinant Human Pigment epithelium-derived factor,rHuPEDF)通过抑制HIF-1α通路在体外抑制肾癌细胞生长,抑制肾癌细胞的侵袭和转移的能力。<br> 方法:1、选取两种肾透明细胞癌株ACHN和caki-1分别用Western blot法和免疫细胞化学法检测HIF-1α和VEGF的水平。2、MTT和CCK-8法检测不同浓度rPEDF对两种细胞的抑制率,选择出24h的最佳抑制浓度,为下一步实验做准备。3、两组细胞各自分成YC-1组(HIF被阻断)和空白组,全部加入最佳抑制浓度的rPEDF,仍然用Western blot和免疫细胞化学方法检测HIF-1α和VEGF的水平,进行比较。4、选用最佳抑制浓度的rPEDF进行划痕实验和Transwell小室实验检测rPEDF对肾癌细胞侵袭力和转移能力的影响。<br> 结果:1、加入rPEDF之前,ACHN和caki-1两种细胞均低表达HIF-1α,高表达VEGF,且两种细胞之间表达强弱有差异但差异不大。2、通过rPEDF对肾癌细胞抑制率的比较,MTT、CCK-8法均得出200ng/mL是24h最佳抑制浓度。3、ACHN和caki-1两种细胞各自分成两组,有一组加入YC-1(HIF阻断剂),另一组不阻断HIF,都加入200ng/mL的rPEDF,结果显示,被YC-1阻断后的细胞,rPEDF对其抑制作用明显减弱,HIF-1α表达水平明显降低,VEGF水平无明显变化,而HIF-1α未被阻断的组,rPEDF对其抑制作用依旧明显,HIF-1α和VEGF水平都明显下降,且这些差异均具有统计学意义。4、划痕实验表明,用200ng/mL的rPEDF处理两组肾癌细胞,分别在第0h、12h和24h取样拍照并测量划痕宽度。结果显示,两组细胞在0h划痕宽度无显著差异;随着作用时间的延长,对照组细胞的划痕距离逐渐缩小,“伤口”明显变小;而实验组划痕距离缩小速度明显减慢,表明rPEDF能明显抑制肾癌细胞的侵袭能力。5、Transwell小室实验也有相同结果,用200ng/mL的rPEDF处理两组肾癌细胞,每个chamber取200μl接种包被好,在Transwell小室下层加入完全培养基DMEM和M5,并分别于6h、12h、24h取出平行小室样本,每个样本随机选取5个视野进行细胞计数。结果显示,两组细胞在8h时透膜细胞数比较无明显差别;实验组16h、24h透膜细胞数明显少于对照组,表明rPEDF能明显抑制肾癌细胞的转移能力。<br> 结论:rPEDF在体外能显著地抑制肾癌细胞的生长、转移和侵袭,而且是通过HIF-1α抑制VEGF的表达这一通路来抑制肿瘤血管的生成,这一通路的具体机制和VHL基因也相关,可作为今后肾癌靶向治疗的一个研究方向。
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