检索历史 清除

摘要背景和目的：<br>　　糖尿病肾病(DN)是引起终末期肾脏病(ESRD)的主要原因之一，其患病率逐年升高。目前关于DN的发病机理尚未完全阐明，现代医学治疗DN的效果仍不能令人满意。目前研究表明，氧化应激是糖尿病肾病的核心，而抗氧化应激的关键在于上调核因子E2相关因子(Nrf2)的活性，中和ROS，促进抗氧化蛋白及酶的释放，如γ-GCS、TrxR1等，缓解系膜细胞增生抑制和肥大，减缓肾功能丢失。目前临床常用的抗氧化剂如维生素E等，不论是临床疗效，亦或是实验结果，都无法给出很好的支持证据，故仍需努力寻找更有效的Nrf2的激活剂。现今，已有很多关于木犀草素药理的研究，提出木犀草素广泛存在于菊花、金银花、透骨草及白毛夏枯草等中药中，具有抗炎、抗氧化应激、拮抗肿瘤等作用。2010年有学者已经发现木犀草素通过下调转化生长因子β(TGF-β)对STZ诱导的糖尿病肾病大鼠模型中有一定的肾脏保护作用。本实验旨在明确木犀草素是否能通过激活Nrf2途径来缓解氧化应激损伤，保护肾脏系膜细胞，延缓糖尿病肾脏病的进展，为糖尿病肾病的治疗提供新的手段。<br>　　研究方法：<br>　　将体外培养的大鼠肾小球系膜细胞分别设正常对照组、高糖组、高糖+木犀草素低剂量组、高糖+木犀草素高剂量组、和高糖+tBHQ组。用荧光素酶报告基因检测法检测不同浓度木犀草素及tBHQ干预下细胞内Nrf2基因表达强度;流式细胞术检测各组系膜细胞内ROS的含量;流式细胞仪法检测各组系膜细胞的大小;绿色荧光蛋白转染法联合细胞免疫荧光法检测单位细胞面积;Ki67间接免疫荧光法检测细胞增殖和凋亡情况;Western Blot法检测高糖环境中木犀草素不同浓度下系膜细胞内的p-p65、Nrf2、TrxR1、γ-GCS的含量。Western Blot法检测不同药物及药物剂量下TrxR1、γ-GCSc及γ-GCSm、Nrf2的含量。<br>　　结果：<br>　　(1)观察到不同浓度木犀草素处理后，Nrf2基因表达强度随着木犀草素的浓度变化呈现递增趋势;25nmol/L、75nmol/L、200nmol/L3个浓度组P＞0.05，无统计学差异;其他浓度组P＜0.05，有统计学差异。同时在阳性对照组tBHQ的不同浓度中Nrf2总体也呈递增趋势，且均有统计学差异（P＜0.05）。<br>　　(2)高糖组中ROS含量较正常组明显升高(P＜0.05)，木犀草素及tBHQ药物干预组ROS量较高糖组减少(P＜0.05)，在tBHQ组中减少最多，同时木犀草素400nmol/L组较木犀草素100nmol/L减少的更多。<br>　　(3)观察到高糖环境中细胞数较正常环境中系膜细胞数明显减少，而在木犀草素及tBHQ组中增多，且木犀草素400nmol/L组中系膜细胞数最多。<br>　　(4)高糖环境中的系膜细胞比其他干预组细胞肥大，木犀草素干预组及tBHQ组系膜细胞与高糖组细胞相比明显减小，且木犀草素400nmol/L组细胞较100nmol/L组细胞更小，提示木犀草素干预效果呈剂量依赖型。<br>　　(5)平均GFP+标记的细胞总面积中，高糖组的系膜细胞面积较正常组明显增大(P＜0.05);而在木犀草素各浓度组及tBHQ组中系膜细胞面积比高糖组小(P＜0.05)，木犀草素400nmol/L组细胞面积较100nmol/L更小。<br>　　(6)用不同浓度的木犀草素作用于系膜细胞后，Western Blot可见Nrf2在木犀草素100nmol/L-400nmol/L及tBHQ组增多，尤其是浓度在木犀草素100nmol/L时增多更为明显;TrxR1在木犀草素100nmol/L-400nmol/L浓度及tBHQ中较正常组增多，且在木犀草素100nmol/L浓度下增多最多;γ-GCSc及γ-GCSm在木犀草素各浓度及tBHQ组增多均较明显，且在木犀草素200nmol/L时增加最多。<br>　　(7)高糖处理系膜细胞后，用木犀草素100nmol/L、400nmol/L及tBHQ干预，Western Blot见高糖组P-P65较正常组增高明显，与高糖组相比，木犀草素及tBHQ干预组明显减少，且在木犀草素中有着浓度相关性的表现;见高糖组Nrf2较正常组稍增多，与高糖组比较，木犀草素各组及tBHQ组升高较明显，尤其在木犀草素100nmol/L组最为明显;TrxR1在高糖组及各药物干预组均升高，集中在木犀草素100nmol/L组中;γ-GCSc在高糖组及木犀草素100nmol/L组升高明显，但与正常组及高糖组相比，木犀草素400nmol/L组及tBHQ组γ-GCSc含量稍低;与正常组相比，γ-GCSm在木犀草素400nmol/L组升高，在其他组均降低，与高糖组相较而言，木犀草素两组含量均稍高。<br>　　结论：<br>　　木犀草素能够通过上调Nrf2激活抗氧化蛋白及抗氧化酶如γ-GCS、TrxR1等的表达，清除ROS，反馈性抑制NF-κ B通路，保护肾脏系膜细胞，延缓肾功能进展。