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摘要腺病毒载体是目前最有应用前景的病毒载体之一，被广泛应用于包括疫苗研发、基因治疗和溶瘤治疗的各种临床前和临床研究。由于人群中普遍存在针对常见的人血清型腺病毒的中和抗体，影响了相应腺病毒载体在临床中的应用。为避免这一问题，研究者采用稀有人血清型或其它种属来源的腺病毒等作为载体。<br>　　本研究以黑猩猩来源的腺病毒AdC68为对象，通过对腺病毒AdC68载体的构建及改造，展开了其作为疫苗和溶瘤病毒载体系统性的研究，包括三部分工作:(1)构建E1区缺失的复制缺陷型腺病毒AdC68载体及表达了EV71病毒VP1抗原的重组腺病毒并探索其作为疫苗载体的潜能;(2)建立了基于等温组装法的腺病毒分子克隆构建体系和重组腺病毒载体的AdIA系统;(3)构建了腺病毒衣壳蛋白pIX展示EGFP的可复制型腺病毒并研究了其作为溶瘤病毒载体的可行性。<br>　　在第一部分工作中，我们采用低熔点胶直接连接法构建了E1区缺失的复制缺陷型腺病毒分子克隆，在HEK293细胞中成功包装出有感染性的病毒颗粒。遗传稳定性及感染效率试验证明，基于黑猩猩来源的腺病毒AdC68可稳定性地传代，能高效地侵入细胞并表达外源基因。基于该载体平台，我们设计并包装出表达经密码子优化的EV71病毒VP1蛋白的重组腺病毒，蛋白质印迹实验表明109vp的病毒滴度感染细胞后即可检测出VP1蛋白的高效表达。经该重组腺病毒免疫小鼠后，仅一次免疫即可激活机体产生强烈的免疫反应，证实黑猩猩来源的腺病毒AdC68具有良好的疫苗载体特性。<br>　　在第二部分工作中，由于腺病毒基因组较大，传统方法构建腺病毒载体复杂且费时，因此我们建立了基于等温组装法构建的E1和E3区双缺失复制缺陷型腺病毒AdC68分子克隆体系。该法先将AdC68基因组分成八个小片段，每两个片段与一个载体组装成一个模块化质粒，然后再将四个大片段组装成E1/E3区缺失的重组腺病毒AdC68分子克隆，在一周之内便可完成所有的构建步骤。此外，我们还建立了等温组装法构造重组腺病毒的体系，称之为AdIA体系，不依赖于中间穿梭载体的克隆，可一步法直接构建重组腺病毒载体。AdIA系统为重组腺病毒载体的构建提供了一种简单、快速且高效的方法。<br>　　在第三部分工作中，利用等温组装克隆法，我们构建了腺病毒衣壳蛋白pIX展示EGFP的可复制型腺病毒，命名为RCAdC68.pIX-EGFP。在A549和HT29肿瘤细胞的体外实验中，我们初步探讨了腺病毒AdC68作为溶瘤病毒载体的潜在价值。该腺病毒能高效感染肿瘤细胞，MTT实验和结晶紫实验均证实，RCAdC68.pIX-EGFP有强效的溶瘤作用，将肿瘤细胞裂解杀死。通过PI染色的流式分析表明该溶瘤腺病毒可通过激活肿瘤细胞的凋亡途径导致肿瘤细胞的死亡。<br>　　综上，我们可以得出如下结论:<br>　　(1)基于黑猩猩来源的腺病毒AdC68可以作为一种优良的疫苗载体，为新型疫苗的研究提供更多的选择;<br>　　(2)等温组装法可快速地模块化构建腺病毒分子克隆，便于对腺病毒进行各种改造修饰;<br>　　(3)AdIA体系是一种简单、快速且高效的构建重组腺病毒的平台;<br>　　(4)基于黑猩猩来源的腺病毒AdC68是一种具有天然的溶瘤特性的腺病毒，可快速有效地杀死肿瘤细胞，因此，可进一步开发成卓越有效的溶瘤病毒。