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摘要目的:<br>　　探讨骨不连瘢痕组织中是否存在一种细胞(NCs)，具有间充质干细胞特性以及压应力刺激对NCs成软骨分化的影响。<br>　　方法:<br>　　1.骨不连细胞的分离、培养和鉴定<br>　　收集人的骨不连瘢痕组织，采用组织块培养法并结合传代获取、纯化细胞，观察细胞形态和表面标志物的表达，从而对其鉴定。MTT法测定第3、5、9代细胞的增殖情况。<br>　　2.骨不连细胞的多分化潜能的研究<br>　　取生长良好的第3代到第5代的细胞，分别用成骨诱导培养基诱导、成脂诱导培养基及成软骨诱导培养基。于成骨诱导7天，行Ⅰ型胶原免疫细胞化学染色，于诱导14天，Western-blot检测ALP，OC，BSP的蛋白含量，于诱导21天，行茜素红钙结节染色;于成脂诱导14天，行油红O染色，并Western-blot检测LPL，PPARγ2的蛋白含量;于成软骨诱导14天后，行番素红染色，并Western-blot检测COLⅡ，COLⅩ，SOX9的蛋白含量。<br>　　3.压应力对骨不连细胞成软骨分化影响的研究和分子机制探讨<br>　　收集第三代到第五代细胞，分别给予10KPa，30KPa，50KPa，70KPa压应力刺激，应用MTT法检测细胞的增殖能力。于加压14天后细胞行Q-PCR检测ColⅡ、ColⅩ、SOX9、TGFβ1的mRNA的含量。采用慢病毒载体介导con-shRNA及TGFβ1-shRNA感染NCs细胞，于96h后行GFP免疫荧光检测阳性率，并Western-blot检测TGFβ1表达量。对感染con-shRNA及TGFβ1-shRNANCs的NCs细胞分成三组，一组为感染con-shRNA未加压组，一组为感染TGFβ1-shRNA未加压组，剩余一组为感染TGFβ1-shRNA加压组。于培养后7天收集细胞行P-smad2，Smad2，TGFβ1，ColⅡ、ColⅩ、SOX9蛋白量的表达。<br>　　结果:<br>　　1.经组织块培养法结合传代所得到的细胞形态均一，呈长梭形，接近融合状态时可呈现旋涡样生长，传第10代细胞的增殖能力减弱，出现宽大梭形，排列紊乱。90％以上的细胞表达CD29和CD44;小于8.5％的细胞表面表达CD34，CD45。经MTT方法检测，第5代细胞增殖能力最佳。<br>　　2.骨不连细胞经成骨诱导后，细胞形态开始逐渐发生改变，局部变成多角形，宽大梭形，细胞内颗粒增多，最后成集落层叠生长，于诱导7天时Ⅰ型胶原免疫细胞化学染色阳性，诱导21天茜素红染色阳性，Western-Blot结果显示，高表达ALP，OC及BSP;经成脂诱导后细胞形态由长梭形逐渐变为圆形，短梭形，正方形，不规则形状，呈现“放射状触须”样改变，最后可见细胞内透亮的脂滴形成。于诱导14天油红O染色阳性，Western-Blot结果显示，高表达LPL及PPAR-γ2;经成软骨诱导后细胞形态逐渐变成圆形，椭圆形及多边形。诱导14天番素红染色阳性，Western-Blot结果显示，高表达ColⅡ,ColⅩ和SOX9。<br>　　3.骨不连细胞给予加压后细胞形态逐渐增大，成宽大形状，细胞分泌物增多，细胞质变得模糊。经MTT检查，细胞增殖能力增强。通过对骨不连干细胞的加压刺激作用，发现软骨细胞分化标志因子ColⅡ、ColⅩ、SOX9，TGFβ1的mRNA表达水平上调，并随着压力增大而上升。采用慢病毒载体介导TGFβ1-shRNA感染NCs细胞，通过GFP荧光检测显示，NCs细胞的慢病毒感染率达80％以上。Westernblot检测TGFβ1表达效率。结果显示，与对照组(Con-shRNA)对比，TGFβ1表达显著抑制，证明慢病毒载体TGFβ1-shRNA能显著下调细胞中TGFβ1的表达。用TGFβ1-shRNA联合压应力处理细胞，发现压应力和TGFβ1-shRNA联合处理细胞后，压应力回复TGFβ1-shRNA对P-Smad2表达的抑制作用。同样回复TGFβ1-shRNA对成软骨细胞标志因子ColⅡ，ColⅩ，SOX9蛋白的抑制作用。<br>　　结论:<br>　　1.骨不连细胞NCs属于一种间充质干细胞，具有干细胞的表型及有多向分化能力。<br>　　2.骨不连细胞NCs经间接压应力刺激后经TGFβ1-Smad2通路向成软骨方向分化。