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摘要第一章 CC1007对肝癌细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡的影响和体内抗肿瘤活性<br>　　目的:研究CC1007对肝癌细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡的影响和体内抗肿瘤活性。<br>　　方法:以不同浓度的CC1007干预肝癌细胞和成纤维细胞一定时间，采用MTT法分析细胞增殖或存活;流式细胞术检测细胞周期分布;利用Hoechst染色及流式细胞仪（AnnexinⅤ/PI双染法）检测细胞凋亡;裸鼠皮下成瘤实验检测CC1007体内的抗肝癌作用。<br>　　结果:<br>　　1.CC1007呈时间和浓度依赖的抑制各组肝癌细胞生存率（各组间比较P＜0.05）。40μM的CC1007干预72 h后，HepG2、PLC/PRF/5、Hep3B、Huh7细胞的存活率分别为（8.2±4.04）％、（2.3±1.78）％、(12.5±7.25)％、（6.6±5.03）％，而成纤维细胞的生存率为（61.1±4.19）％（与各肝癌细胞比较，P＜0.05）;CC1007干预72 h，HepG2、PLC/PRF、Huh7、Hep3B细胞以及皮肤成纤维细胞的IC50分别为27.1μM、2.6μM、12.12μM、5.6μM和＞40μM。<br>　　2.CC1007干预24 h后，HepG2细胞G0/G1期细胞比例升高、S期细胞比例下降。对照组(1‰DMSO)、10μM、20μM及40μM组G0/G1期细胞比例分别为61.1％、79.4％、80.2％、77.8％，S期细胞比例分别为28.5％、12.1％、12.6％、19.3％。<br>　　3.Hoechst33258染色结果显示CC1007干预HepG2细胞48 h后，HepG2细胞核呈现典型的凋亡形态改变。AnnexinⅤ/PI双染法检测胞凋亡结果显示CC1007干预48 h后，细胞凋亡率随着浓度而升高，40μM CC1007干预48 h后， HepG2、PLC/PRF/5、Huh7、Hep3B细胞的凋亡率分别为（41.43±1.7）％(与对照组比较，P＜0.05)、（70.46±10.48）％(与对照组比较，P＜0.05)和（23.63±2.68）％(与对照组比较，P＜0.05)、（20.23±2.97）％(与对照组比较，P＜0.05)。<br>　　4.50mg/kg/d的CC1007对裸鼠皮下移植瘤体积的抑制率为55.4％(n=5，P＜0.05)，而对小鼠体重没有影响。<br>　　结论:<br>　　1.CC1007对肝癌细胞具有选择性抑制作用，CC1007呈浓度和时间依赖性的降低肝癌细胞存活率，而成纤维细胞对CC1007的耐受性高于肿瘤细胞。<br>　　2.CC1007阻滞HepG2细胞周期于G0/G1期;10μM浓度的CC1007即能有效地阻滞细胞周期。<br>　　3.CC1007能够诱导肝癌细胞凋亡。<br>　　4.CC1007能够抑制裸鼠肝癌移植瘤的生长。<br>　　第二章 CC1007抗肝癌机制的初步探讨<br>　　目的:初步探讨CC1007抗肝癌的作用机制<br>　　方法:CC1007干预肝癌细胞一定时间后，采用Westren blot法检测乙酰化H3(Ace-H3)、乙酰化H4(Ace-H4); RT-PCR、Westren blot法检测周期抑制蛋白p21的表达;RT-PCR、Westren blot法检测Nur77的表达;Caspase3/7 assay及Westren blot检测Caspase的活化。<br>　　结果:<br>　　1.CC1007干预肝癌细胞24 h后，HepG2、PLC/PRF/5、Hep3B、Huh7细胞的Ace-H3、Ace-H4表达均增加。<br>　　2.CC1007干预肝癌细胞后，HepG2细胞p21的mRNA和蛋白表达量都增加。<br>　　3.不同浓度CC1007干预肝癌细胞30h后，Caspase3/7 assay发现HepG2、PLC/PRF/5细胞的Caspase3/7被激活，进一步的Westrenblot检测发现Caspase9和Caspase3被活化，而Caspase8没有被激活。<br>　　4.CC1007干预肝癌细胞20 h后，RT-PCR显示Nur77mRNA表达升高;干预24 h小时后Westren blot显示Nur77蛋白表达升高。<br>　　结论:<br>　　1.CC1007能够诱导肝癌细胞组蛋白乙酰化水平增加。<br>　　2.CC1007诱导p21表达增加可能参与细胞周期阻滞。<br>　　3.CC1007激活内源性凋亡通路。<br>　　4.CC1007诱导凋亡相关因子Nur77的表达。<br>　　第三章 Nur77在CC1007诱导肝癌细胞凋亡中的作用<br>　　目的:探讨Nur77在CC1007诱导肝癌细胞凋亡中的作用<br>　　方法:CC1007干预HepG2细胞一定时间后，采用免疫荧光法激光共聚焦检测Nur77在细胞内的定位变化;采用western blot检测Nur77在胞浆和胞核的表达变化;建立稳定干扰Nur77的HepG2细胞株，采用MTT法检测细胞存活率、hoechst染色计数凋亡细胞比例、流式细胞仪检测SubG1期细胞比例。<br>　　结果:<br>　　1.免疫荧光激光共聚焦显示40μM的CC1007干预24 h后，HepG2细胞中Nur77表达量升高，浓聚于细胞核;干扰30h后，Nur77主要定位于胞浆并且与线粒体存在共定位。<br>　　2.Western blot显示:40μM的CC1007干预24 h后，细胞核内Nur77表达升高，细胞浆内Nur77表达量不变;干预30 h后，细胞核内Nur77表达下降，细胞浆内Nur77表达升高。<br>　　3.40μM的CC1007干预Nur77干扰组和对照干扰组细胞30 h后，MTT显示存活率为分别为（77.4±2.7）％和（63.4±0.8）％(P＜0.05)，Hoechst染色计数显示凋亡率分别为（43.1±1.8）％和（52.13±0.5）％(P＜0.05)，流式细胞仪检测显示sub-G1期细胞比例分别为（24.04±2.8）％和（30.4±2.0）％(P＜0.05)。<br>　　结论:<br>　　1.CC1007诱导HepG2凋亡过程中首先细胞核内Nur77蛋白表达量升高，随后Nur77出细胞核至细胞浆和线粒体。<br>　　2.下调Nur77能够降低HepG2细胞对CC1007的敏感性。<br>　　3.CC1007诱导的Nur77起促凋亡作用。