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摘要目的:<br>　　泛素-蛋白酶体系统(UPS)是细胞内蛋白质主要的降解途径之一，广泛参与了应激反应、细胞周期、凋亡及细胞信号传导、离子通道调节、蛋白质分泌在内的调节过程。在阿尔兹海默症、帕金森病、肌肉侧索硬化症等神经退行性疾病中，泛素-蛋白酶体系统受到抑制在疾病的发生过程中发挥了一定的作用。钙网蛋白(calreticulin)/钙联接蛋白(calnexin)(CRT/CNX)是内质网中重要的糖蛋白折叠监控系统，正确折叠的蛋白质留在内质网中或转运到相应的细胞器或胞外;轻度或中度错误折叠的蛋白质在CRT/CNX质量监控系统的协助下重新折叠;高度错误折叠而无法修复的蛋白质被逆转运到胞浆中被蛋白酶复合体降解，泛素-蛋白酶复合体失活和CRT/CNX糖蛋白质量监控系统功能紊乱将导致死亡或发育延迟。本课题主要研究在神经元损伤早期，蛋白酶复合体抑制情况下，内质网糖蛋白质量监控系统的改变，以及其改变机制，并在帕金森氏动物模型中研究蛋白酶复合体抑制对内质网质量监控系统的调控<br>　　方法：<br>　　1.蛋白酶体活性检测实验<br>　　取孕18天SD-大鼠胚胎，分离皮质及黑质区组织进行原代神经元培养，7天后用非变性细胞裂解液裂解细胞，提取蛋白。将提取的蛋白质和蛋白酶复合体酶切底物LLVY-AMC共同孵育，蛋白酶复合体在糜蛋白酶切割作用下产生AMC，在Ex380nm、Em440nm下检测荧光值，荧光值和蛋白质的比值表示蛋白酶体复合体的活性。<br>　　2.细胞毒性试验<br>　　将CRT稳定knockdown的SH-SY5Y细胞用不同浓度6-羟基多巴胺处理24小时后，加MTS检测吸光度，MTS是四唑类化合物，可被活细胞的线粒体内多种脱氢酶还原成橙黄色的formazan，从而反应细胞活力。<br>　　3.用ELISA检测经不同浓度蛋白酶体抑制剂处理的皮质及黑质区原代神经细胞上清中分泌的calreticulin。<br>　　4.Western blot检测蛋白酶复合体抑制剂处理原代培养神经元后，内质网质量监控系统CRT/CNX组分calreticulin，calnexin，ERp57的表达变化。<br>　　5.用立体定位仪向SD-大鼠单侧纹状体定位注射6-羟基多巴胺建立帕金森氏病动物模型，提取大鼠双侧皮质、纹状体、中脑蛋白质，对比检测calreticulin，calnexin，ERp57和GRP78的变化，并做免疫组化分析相应蛋白质的改变。<br>　　结果：<br>　　1.在神经元未发生凋亡的前提下，1um蛋白酶复合体抑制剂处理原代神经元后，CRT、ERp57的蛋白水平下降，而CRT/CNX质量监控系统的calnexin及内质网中另一分子伴侣GRP78蛋白水平没有改变;在蛋白酶复合体抑制剂处理神经元的上清中检测到CRT含量增加，当加入抑制蛋白质从内质网向高尔基体转运的特异性蛋白转运抑制剂Brefeldin A后，这种变化受到抑制。<br>　　2.在多巴胺能神经元细胞系SH-SY5Y中稳定knockdown CRT，增加了SH-SY5Y对多巴胺能神经毒素6-羟基多巴胺的毒性敏感性。<br>　　3.在帕金森动物模型中，6-羟基多巴胺注射侧黑质区CRT和ERp57表达与对照侧相比显著下降，而GRP78和calnexin没有变化;同时黑质区神经元细胞的蛋白酶复合体活性较对侧明显降低，双侧大脑皮质、纹状体中CRT、ERp57、CNX、GRP78对比没有差异，蛋白酶复合体活性也没有改变。<br>　　结论：<br>　　蛋白酶复合体抑制在不引起神经元凋亡的前提下，减少内质网CRT/CNX质量监控系统蛋白质组分CRT，ERp57的蛋白质含量，CRT的减少是由于蛋白酶复合体抑制剂促进其外分泌;降低胞内CRT水平增加SH-SY5Y对神经毒素的敏感性;在帕金森动物模型，中脑黑质蛋白酶复合体活性下降，CRT和ERp57表达降低。体内和体外实验发现内质网CRT/CNX糖蛋白监控系统组分的减少与蛋白酶复合体活性下降密切相关。至于蛋白酶复合体抑制引起内质网糖蛋白质量监控系统组分降低的机制还在研究之中。