检索历史 清除

摘要第一部分丝蛋白-壳聚糖支架的制备及其特性测定<br>　　研究目的:<br>　　探索一种更接近皮肤的组织工程支架材料，本实验拟采用溴化锂-水溶丝体系溶解丝素蛋白，制备丝素蛋白-壳聚糖共混支架。<br>　　方法:<br>　　采用了溴化锂-水溶丝体系溶解丝素蛋白，降低丝素蛋白分子的降解，将溶解壳聚糖的醋酸浓度减小到更低水平，以防止混合过程中的丝素蛋白分子的过快变性。本实验共制备了纯SF以及SF/CS比例3∶1，6∶1，9∶1的共混材料。扫描电镜(SEM)观察制备的共混支架材料的表观和断面形态;Image J测量各支架孔径;测定各支架吸水率;通过电子拉力机对所制备材料的力学性能进行测试。<br>　　结果:<br>　　SEM观察到材料为内部多孔的海绵状结构，断面均匀且没有宏观分相的情况出现。随着SF的浓度增大，所制备的SF/CS共混支架材料的孔径大小从120±18.2μm逐渐减小到52.1±4.8μm。纯的SF支架则需要大于5 min的时间;而不同比例的SF/CS共混支架材料在1～3 min都达到了溶胀平衡。机械强度测试提示SF/CS多孔共混支架材料均具有较好的断裂强度和一定的柔韧性能，纯SF材料的强度最大，为430±54kPa。<br>　　结论:<br>　　采用溴化锂-水溶丝体系将丝素蛋白和壳聚糖进行共混，共混支架材料具备较好的力学性能，在SEM的断面图上没有出现宏观的组分间相分离;吸水速率大幅度提升;机械强度测试提示SF/CS多孔共混支架材料均具有较好的断裂强度和一定的柔韧性能。<br>　　第二部分脂肪干细胞的分离、培养、鉴定<br>　　研究目的:<br>　　从SD大鼠腹股沟处脂肪提取脂肪干细胞，了解脂肪干细胞是否具有多向分化的潜能。<br>　　方法:<br>　　自SD大鼠（7周龄，体重190±21.4g）的大鼠双侧腹股沟处切取脂肪组织约5g，经常规酶消化法提取脂肪干细胞，观察其细胞形态，并绘制生长曲线;采用单克隆抗体标记ADSCs，然后采用流式细胞仪测定干细胞表面标志物:CD29、CD34、CD44、CD90;通过诱导分化剂的诱导，将ADSCs诱导分化成脂、成骨，通过油红“O”染色、茜素红染色和Von kussa染色了解干细胞成脂、成骨情况。<br>　　结果:<br>　　SD大鼠腹股沟脂肪分离培养的细胞，具有干细胞的形态和特性，经流式细胞仪检测其表面标志物的表达为CD29，CD44，CD90呈阳性表达，阳性率分别为93％，98％，96％，而CD34表达呈阴性表达(0％);经定向诱导，发现ADSCs具有成脂、成骨多向分化的潜能。<br>　　结论:<br>　　脂肪干细胞(ADSCs)分离培养简单，获取容易，具有较好干细胞特性，传代稳定。<br>　　第三部分脂肪干细胞与丝蛋白-壳聚糖材料体外培养和生物学活性的研究<br>　　研究目的:<br>　　采用溴化锂-水溶丝体系制备的纯SF及SF/CS比例3∶1，6∶1，9∶1的共混材料，与ADSCs共培养，观察不同支架上ADSCs的生长状态及增殖情况。<br>　　方法:<br>　　ADSCs与纯SF及SF/CS共混材料共培养，分别在细胞培养的第1、3、7、10d时，CCK-8测定细胞增殖情况，第10d时，trizol法提取支架上细胞的RNA，用RT-PCR法检测其Ki67的表达量。将细胞浓度为5×104/ml的ADSCs与材料在体外共同培养，电镜下观察ADSCs的生长情况。<br>　　结果:<br>　　ADSCs在第1、3、7、10d增殖过程中， SF/CS共混材料3∶1组最接近对照组，在第1、3、7、10d其增值速度明显快于6∶1组，9∶1组及纯SF组，其中纯SF组ADSCs增殖速度最慢， P＜0.05，差别有显著性。RT-PCR结果提示:SF/CS比例3∶1组相对定量值为1.27±0.46，6∶1组为0.74±0.23，9∶1组为0.67±0.31，纯SF组为0.43±0.19。ADSCs在SF/CS共混材料上培养的第3d，扫描电镜观察提示，细胞形态呈长梭形，表面光滑，形态完整，伸出较多足突与SF/CS共混材料黏附紧密。<br>　　结论:<br>　　SF/CS共混材料与ADSCs生物相容性好，其中3∶1组ADSCs增殖速率明显高于6∶1组，9∶1组及纯SF组。