肝癌细胞唾液酸糖基转移酶与细胞膜表面唾液酸糖链的相关性研究-论文-万方医学网

肝癌细胞唾液酸糖基转移酶与细胞膜表面唾液酸糖链的相关性研究

二维码有效期 120s

收藏纠错

摘要原发性肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是世界上常见、高度恶性的肿瘤，其死亡率极高，极大地威胁着人类的健康。因此，肝癌发病机制的研究是目前世界各国研究的重点。有文献表明，细胞膜表面糖链与细胞内糖基转移酶表达的改变密切相关，因此，探讨肝癌细胞唾液酸糖基转移酶与细胞膜表面糖链的相关性，将为肝癌的预防、早期诊断和治疗提供重要的理论依据。 　　糖链的合成是通过一系列定位有序的糖基转移酶催化完成的，糖基转移酶表达的差异将导致细胞膜表面糖链表达的改变，并参与细胞增殖调控。因此，研究糖基转移酶的表达及其影响因素不仅可以阐明细胞膜表面糖链变化的原因，还能揭示糖基转移酶在肿瘤发生发展过程中发挥的重要作用。 　　细胞膜表面唾液酸糖链是由唾液酸糖基转移酶催化合成的。目前已经发现人类基因组中的唾液酸转移酶有20种，根据转移唾液酸糖基后新形成的糖苷键的类型可以将唾液酸糖基转移酶进一步细分为四类:ST3Gal、 ST6Gal、 ST6GalNAc和ST8Sia。目前，科学家们认识到肿瘤细胞膜表面唾液酸含量增加的同时肿瘤细胞唾液酸转移酶表达也发生变化，但是关于肝癌细胞中唾液酸转移酶四大家族基因表达与细胞膜表面唾液酸糖链表达的相关性国内外尚无报道。 　　在本实验室的前期工作中，我们应用凝集素芯片及RT-PCR技术对小鼠正常肝细胞系及小鼠肝癌细胞系细胞膜表面糖链表达情况进行了检测，发现肝癌细胞膜表面糖链的种类和数量都发生了改变，其中唾液酸糖链表达增加。 　　本课题在第一部分中旨在探讨肝癌细胞唾液酸糖基转移酶与细胞膜表面唾液酸糖链表达的相关性。首先，我们应用凝集素芯片对人正常肝细胞系L-02及人肝癌细胞系HepG-2、SMMC-7721细胞膜唾液酸表达进行检测。接下来，应用唾液酸糖基转移酶基因芯片对唾液酸转移酶ST3Gal、 ST6Gal、 ST6GalNAc、ST8Gal四大家族20个成员的表达进行检测。最后应用实时定量PCR技术和Western-blot技术，验证了基因芯片的检测结果。通过对比分析研究了唾液酸糖基转移酶四大家族成员的表达与细胞膜唾液酸糖链的相关性。 　　细胞糖基转移酶表达的差异不仅可以影响细胞膜糖链的表达还参与细胞多种神经节苷脂的合成[15]。ST3GalⅤ是ST3Gal家族的一员，也叫做GM3合酶，其表达含量的高低目前已作为检测GM3含量的直接标准。在细胞膜神经节苷脂合成过程中，乳糖神经酰胺在ST3GalⅤ催化下合成神经节苷脂GM3，GM3在B4galntⅠ催化下合成神经节苷脂GM2，GM2经过ST3GalⅠ等进一步催化合成GD1a，GD1a能通过负调控caveolin-1影响细胞增殖。有研究显示，膀胱癌中GM3与CD9形成复合物，GM2与CD82形成复合物，可以通过不同信号转导通路控制细胞增殖和迁移。有文献报道，在某些癌症中GM3单纯降低，CD9表达无变化。因此，在这些癌症的治疗中单纯增加外源性GM3可以很好地抑制肿瘤细胞的生长增殖。但目前尚无关于人肝癌GD1a合成路径中各基因表达及其相关性的报道。为了验证在肝癌细胞GD1a合成路径中除了GM3和GM2减少外，是否还有CD9和CD82表达的降低，我们在第二部分实验中，通过实时定量PCR技术对三种细胞系神经节苷脂GD1a合成路径中相关基因ST3GalⅤ、ST3GalⅠ、B4galntⅠ、CD9和CD82的表达进行了检测，力求发现它们在肝癌细胞中表达的相关性，为肝癌的临床治疗提供可靠的理论依据。 　　目前有文献报道，CD82的表达受TP53基因调控[16]。为了检测与CD82表达相关的其它基因和糖基转移酶是否也受TP53基因调控，我们在接下来的实验中，用siRNA干扰了人正常肝细胞系L02的TP53基因，通过实时定量PCR技术对干扰TP53基因的人正常肝细胞系L02中20种唾液酸糖基转移酶、B4galntⅠ、CD9和CD82的基因表达情况进行了检测。有研究显示，TP53基因和转录因子HSF4同时敲除的肿瘤小鼠与单独敲除TP53基因的小鼠相比肿瘤发生明显受到抑制。为了进一步探讨肝癌细胞唾液酸糖基转移酶及GD1a合成路径中相关基因表达的影响因素，我们在接下来的实验中又对人肝癌细胞系SMMC-7721的HSF4进行了siRNA干扰，并通过实时定量PCR技术对干扰后的人肝癌细胞系SMMC-7721进行了ST3GalⅤ、ST3GalⅠ、B4galntⅠ、CD9和CD82表达的检测。最后，我们应用抗癌药顺铂处理了人肝癌细胞系SMMC-7721细胞，通过实时定量PCR技术对顺铂处理后的人肝癌细胞系SMMC-7721细胞进行了TP53、HSF4、ST3GalⅤ、CD9和CD82表达的检测。力求找到肝癌细胞唾液酸糖基转移酶表达的影响因素及其表达与细胞膜表面糖链的相关性，为探讨唾液酸糖基转移酶在肝癌发生发展过程中的作用提供有力的理论依据，为肝癌的临床治疗提供新的靶点。 　　方法: 　　1、凝集素芯片检测细胞膜表面糖链 　　利用凝集素芯片对L-02、HepG-2、SMMC-7721细胞系细胞膜表面糖链进行检测，得出三种细胞系细胞膜糖链的表达谱。 　　2、基因芯片检测唾液酸糖基转移酶表达 　　利用基因芯片技术检测人正常肝细胞系L-02及肝癌细胞系HepG-2和SMMC-7721中差异表达的唾液酸糖基转移酶基因 　　3、Realtime PCR验证基因芯片检测结果 　　Realtime PCR检测L-02、HepG-2、SMMC-7721细胞系在基因芯片中差异表达的唾液酸转移酶mRNA表达。 　　4、Western blot方法检测蛋白表达 　　Western blot方法检测L-02、HepG-2、SMMC-7721细胞系在基因芯片中差异表达的唾液酸转移酶的蛋白表达。 　　5、Realtime PCR检测GD1a合成路径中相关基因的mRNA表达 　　Realtime PCR检测L-02、HepG-2、SMMC-7721细胞系中ST3GalⅤ、ST3GalⅠ、B4galntⅠ、CD9和CD82的mRNA表达。 　　6、siRNA干扰人正常肝细胞系L02细胞的TP53基因 　　siRNA干扰人正常肝细胞系L02细胞的TP53基因，通过实时定量PCR技术检测干扰效果。 　　7、实时定量PCR检测干扰TP53基因后相关基因的mRNA表达 　　通过实时定量PCR技术对干扰TP53基因的人正常肝细胞系L02细胞中20种唾液酸糖基转移酶、B4galntⅠ、CD9和CD82的基因表达情况进行检测。 　　8、实时定量PCR检测干扰HSF4基因后相关基因的mRNA表达 　　实时定量PCR检测干扰人肝癌细胞系SMMC-7721HSF4基因后ST3GalⅠ、ST3GalⅤ、B4galntⅠ、CD9和CD82的mRNA表达。 　　9、顺铂处理人肝癌细胞系SMMC-7721细胞 　　应用抗癌药顺铂处理人肝癌细胞系SMMC-7721细胞，并检测处理后ST3GalⅤ、CD9、CD82、HSF4和TP53的表达。 　　10、对实验数据进行统计学处理 　　应用图像采集分析系统分析数据，所得数据用均数±标准差（(x)±s）表示，应用SPSS13.0统计软件，用单因素方差分析进行组间比较，P＜0.05为有统计学意义，P＜0.01为有显著统计学意义。 　　结果: 　　1、凝集素芯片检测细胞膜表面糖链结果 　　L-02、 HepG-2、SMMC-7721三种细胞系表面均有岩藻糖、唾液酸、甘露糖、N-乙酰葡萄糖、N-乙酰半乳糖糖链。其中人肝癌细胞系HepG-2、SMMC-7721中唾液酸糖链高表达，末端α1，3-甘露糖糖链低表达;三种细胞系中只有SMMC-7721细胞膜表面含有末端N-乙酰半乳糖胺。 　　2、基因芯片检测唾液酸糖基转移酶表达结果 　　基因芯片检测三种细胞系唾液酸糖基转移酶表达结果发现了7个差异表达的糖基转移酶基因。其中，ST3GalⅣ、ST6GalⅠ呈现高表达，ST3GalⅠ、ST3GalⅤ、ST3GalⅥ、 ST6GalNAcⅡ、 ST6GalNAcⅥ呈现低表达，其余唾液酸糖基转移酶表达无明显差异。 　　3、Realtime PCR验证基因芯片检测结果 　　用实时定量PCR进一步检测基因芯片中差异表达的唾液酸糖基转移酶在L-02、HepG-2、SMMC-7721细胞系中的mRNA表达水平，结果与基因芯片检测结果一致。 　　4、Western blot方法检测蛋白表达结果 　　Western blot检测后发现，HepG-2、SMMC-7721中ST3GalⅣ、 ST6GalⅠ蛋白高表达;ST3GalⅠ、ST3 GalⅤ、ST3GalⅥ、 ST6GalNAcⅡ和ST6GalNAcⅥ蛋白低表达;其它蛋白表达无明显差异。检测结果与基因芯片结果一致。 　　5、Realtime PCR检测GD1a合成路径中相关基因的mRNA表达 　　Realtime PCR检测结果显示:ST3GalⅠ、ST3GalⅤ、B4galntⅠ、CD9和CD82在肝癌细胞SMMC7721中表达均降低，有明显的相关性。 　　6、siRNA干扰人TP53基因的干扰结果 　　通过实时定量PCR检测我们发现干扰成功，干扰效率最高的片段是片段2，效率达到90％。 　　7、实时定量PCR检测干扰TP53基因后相关基因的mRNA表达结果 　　通过检测我们发现干扰TP53基因的人肝细胞系L02中，ST3GalⅤ表达升高，CD82表达下降，ST6GalⅠ表达降低， ST6GalNAcⅡ和ST6GalNAcⅥ表达下降，其余唾液酸糖基转移酶和基因变化不明显。 　　8、实时定量PCR检测干扰HSF4基因后相关基因的mRNA表达结果 　　通过检测我们发现干扰HSF4基因的人肝癌细胞系SMMC-7721中，ST3GalⅤ、CD9均表达升高，其表达有明显的相关性。CD82、ST3GalⅠ和B4galntⅠ无明显变化。 　　9、顺铂处理人肝癌细胞系SMMC-7721 　　与处理前相比，顺铂处理后的SMMC-7721细胞中TP53表达明显升高，ST3GalⅤ、CD9和CD82的表达均有不同程度的升高，HSF4表达降低。 　　结论: 　　1、人肝癌细胞系HepG-2和SMMC-7721与人肝正常细胞系相比，三种细胞系表面均有岩藻糖、唾液酸、甘露糖、N-乙酰葡萄糖、N-乙酰半乳糖糖链，其中人肝癌细胞系HepG-2、SMMC-7721中唾液酸糖链高表达，末端α1，3-甘露糖糖链低表达;三种细胞系中只有SMMC-7721细胞膜表面含有末端N-乙酰半乳糖胺。 　　2、人肝癌细胞系HepG-2和SMMC-7721唾液酸糖基转移酶四大家族中， ST3GalⅣ、ST6GalⅠ高表达，它们与细胞膜α2，3唾液酸糖链和α2，6唾液酸糖链的高表达相关;ST3GalⅠ、ST3GalⅤ、ST3GalⅥ、ST6GalNAcⅡ、ST6GalNAcⅥ均低表达;其余唾液酸糖基转移酶基因表达无明显差异。 　　3、神经节苷脂GD1a合成路径中ST3GalⅠ、ST3 GalⅤ、B4galntⅠ、CD9与CD82在肝癌中表达均降低，有明显相关性。 　　4、ST3GalⅠ、ST3GalⅤ、B4galntⅠ、CD9和CD82虽然表达有相关性，但不同时受TP53基因的调控。 　　5、ST3GalⅤ表达与HSF4基因负相关，这种相关性受TP53基因表达水平的影响。 　　6、ST6GalⅠ不直接受TP53基因的调控，ST6GalNAcⅡ和ST6GalNAcⅥ的表达与TP53基因正相关。