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摘要目的：动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)所致心血管疾病（cardiovascular disease，CVD）是终末期肾脏病(end stage renal disease，ESRD)常见的并发症和主要死亡原因。与AS发生相关的主要危险因素包括脂代谢异常和微炎症反应等。研究发现，慢性炎症在加速脂代谢紊乱介导的AS等靶器官损伤中扮演重要作用。炎症能够通过介导低密度脂蛋白受体(low-densitylipoprotein receptor, LDLr)表达失调，导致细胞内胆固醇摄入增加，破坏细胞内胆固醇稳态调节，但该作用可被雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of Rapamycin, mTOR)抑制剂-雷帕霉素所抑制，提示mTOR信号激活可能参与了炎症诱导的LDLr表达失调。然而，mTOR信号如何被激活、活化的mTOR信号是否参与LDLr的表达失调以及具体的作用机制如何，目前尚不十分清楚。因此，本研究拟在此基础上，通过临床研究，体内、体外研究，探讨mTOR通路激活在炎症及脂代谢紊乱介导的靶器官损伤中的作用及其可能的作用机制。<br>　　方法:研究内容包括血管损伤和肝脏损伤研究，血管损伤研究又包括临床研究和基础研究。血管损伤临床研究，观察炎症诱导LDLr表达失调在ESRD患者桡动脉泡沫细胞(foam cell，FC)形成中的作用，并初步探讨mTOR通路激活与LDLr表达失调是否具有相关性。30例ESRD患者被纳入研究，根据血清C反应蛋白水平分为对照组(n=16)和炎症组(n=14)，取材动-静脉内瘘手术时部分切除的桡动脉组织。搜集两组患者的基础临床资料，采用HE及油红O染色观察桡动脉内FC形成情况，免疫化学染色检测mTOR、LDLr及其基因转录调节相关因子的表达。血管损伤基础研究，观察mTORC1激活在炎症介导AS发生中的作用，探索mTORC1在LDLr负反馈调节失调中的作用及可能作用机制。体内研究，将高脂喂养的8周龄雄性载脂蛋白E基因敲除(apolipoprotein E knockout, ApoE KO)小鼠随机分为对照组，炎症组，雷帕霉素组，炎症+雷帕霉素组。8周后处死小鼠，收集血浆标本及主动脉组织;体外研究，选择脂多糖刺激大鼠血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)，同时应用雷帕霉素或siRNA方法抑制mTOR活性。ApoE KO小鼠血清用于检测脂质谱及炎症因子水平，HE及油红O染色观察胞内脂质积聚情况，流式细胞仪测定细胞周期，免疫组化、免疫荧光染色、Real-time PCR及Western Blot法检测组织及细胞内LDLr负反馈通路调节因子、mTORC1信号通路相关蛋白以及细胞周期蛋白的表达情况。肝脏损伤研究，观察mTORC1激活在炎症介导肝脏损伤发生中的作用，探讨mTORC1对LDLr转录水平和转录后水平表达失调的影响。体内研究所用的动物模型，与第二部分相同，观察对象为肝脏组织。体外研究，应用白介素1β(interleukin-1β，IL-1β)联合雷帕霉素或mTOR siRNA方法，干预人肝细胞株(Human hepatoblastoma cell line，HepG2 cell)，并通过病理染色及化学酶促-比色法观察肝脏细胞内脂质积聚情况，免疫组化、免疫荧光染色、Real-time PCR及Western Blot法检测组织及细胞内LDLr转录及转录后水平调节因子以及mTOR信号通路相关因子表达情况。<br>　　结果:1）炎症组与对照组ESRD患者在临床基本生化等指标均无明显差异;炎症组患者桡动脉肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF-α)及单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemotacticprotein1，MCP-1)表达增加，并伴随大量脂质沉积;对介导细胞内胆固醇摄取的LDLr进行研究，发现炎症组患者桡动脉LDLr表达及固醇调节元件结合蛋白-2（sterol regulatory dementbinding protein-2，SREBP-2）裂解激活蛋白（SREBP cleavage-activating protein，SCAP）由内质网向高尔基体的转位显著增加。进一步分析显示，炎症组LDLr表达增加与mTOR表达上调呈显著正相关(r=0.733，p＜0.05);且炎症组mTOR与SREBP-2共表达明显高于对照组。2）通过皮下注射酪蛋白，成功构建微炎症动物模型，且炎症能够诱导脂质重分布，由血液循环向主动脉组织内转运，而雷帕霉素组小鼠主动脉形态完整，且仅少量脂质沉积;这一效应与炎症诱导mTOR激活，导致LDLr负反馈调节失衡密切相关，炎症增加LDLr、SREBP-2、SCAP表达，并促进SCAP由内质网向高尔基体共转位;然而，应用雷帕霉素或mTOR siRNA干预细胞后，胞内mTORC1活性被抑制，且LDLr及其转录调节因子SREBP-2、SCAP表达亦随之减少。进一步研究证实，炎症状态下mTORC1能够磷酸化激活细胞周期蛋白-视网膜母细胞瘤蛋白(retinoblastoma tumour suppressor protein, Rb)，并增加细胞内活性SREBP-2在细胞周期S期的表达，进而启动LDLr基因转录。3）应用微炎症模型观察对肝损伤的影响，结果证实，炎症能够诱导脂质从血液循环向肝脏组织内转运，而雷帕霉素能够明显减少肝细胞内脂质沉积;炎症显著增加肝脏细胞LDLr表达，其转录水平调控元件SREBP-2及SCAP表达亦显著增加，而转录后水平调节因子前蛋白转化酶枯草溶菌素9(Proprotein convertasesubtilisin kexin type9，PCSK9)表达则减少;进一步研究发现，炎症诱导的LDLr表达失调与mTORC1通路激活密切相关，炎症能够诱导mTORC1通路激活，而雷帕霉素或mTOR siRNA干预后，胞内mTORC1活性明显降低，且LDLr、SREBP-2及SCAP表达亦随之减少，而PCSK9表达增多。<br>　　结论:<br>　　1、微炎症状态下，ESRD患者AS进展加速，其机制与炎症诱导mTOR通路激活，破坏LDLr负反馈调节，导致细胞内胆固醇摄入增加，促进FC形成有关。<br>　　2、体内、外研究发现，炎症状态下mTORC1磷酸化激活细胞周期蛋白Rb，可能通过大量增加细胞内活性SREBP-2在细胞周期S期的表达，启动LDLr的基因转录，从而破坏LDLr负反馈调节，导致细胞内胆固醇沉积增多，进而演变为FC，加速AS进展。<br>　　3、肝脏作为胆固醇代谢的重要器官，mTORC1通路激活参与炎症介导的LDLr转录和转录后水平表达失调，导致肝细胞内LDLr表达增强，细胞对胆固醇摄取增多，最终促进肝脏损伤。<br>　　4、本研究阐明了炎症介导的脂代谢紊乱在靶器官损伤中存在共同的信号通路，mTORC1通路激活在其中发挥着重要作用;其中mTOR主要通过参与炎症介导细胞对胆固醇的摄取，导致胆固醇在血管及肝脏组织内沉积，介导靶器官损伤，这一研究为临床应用mTORC1抑制剂防治CKD患者CVD的发生，提供了新的实验依据。<br>