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摘要目的:以体外培养的食管鳞状细胞癌细胞株TE13为实验对象，通过放射线反复照射筛选出的具有EMT样表型的放射抗性细胞株TE13R120，并利用转化生长因子-β1（Transforming Growth Factor-β1，TGF-β1）诱导TE13细胞发生上皮间质转化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)，建立EMT细胞模型。对TE13细胞株、EMT模型细胞和TE13R120细胞进行Real-Time PCR、Western blot、免疫细胞化学检测，测定这三株细胞株中神经营养因子受体（neurotrophin receptor p75 interacting MAGEhomologue，NRAGE）基因的表达和细胞内定位情况。探讨食管癌细胞中NRAGE亚细胞定位在EMT与放射抗性形成中的作用，对深入研究食管癌细胞的恶性生物学行为具有重要意义，为放射抗性造成的放疗失败提供一种新的思路和实验依据，同时也为肿瘤治疗提供了新的靶点。<br>　　方法:人食管鳞状细胞癌细胞株TE13常规培养，待细胞进入对数生长期后用于实验。实验分为三组:TE13细胞组、EMT细胞模型组、TE13R120细胞组，通过Real-Time PCR、Western blot和免疫细胞化学三种实验技术分别检测NRAGE的mRNA表达情况及总蛋白、胞浆蛋白、胞核蛋白的表达情况。其中TE13R120细胞株经过放射线反复照射筛选TE13累积剂量120Gy所得，通过细胞克隆形成实验验证其放射抗性。并通过倒置显微镜观察细胞形态学改变，通过Western blot、Real-Time PCR检测EMT相关标志物E-cadherin、Vimentin的蛋白表达和mRNA表达情况验证EMT样表型的存在。EMT细胞模型利用TGF-β1诱导TE13细胞株所得，并通过倒置显微镜观察细胞形态学改变，Western blot、Real-TimePCR检测EMT相关标志物E-cadherin、Vimentin的蛋白表达和mRNA表达情况验证是否诱导成功。统计学方法采用SPSS17.0软件包进行数据分析，计量资料以均数±标准差表示，两组之间的比较采用独立样本t检验，P＜0.05即认为有统计学意义。<br>　　结果:<br>　　1.建立放射抗性细胞株TE13R120，并验证其放射抗性及存在EMT样表型<br>　　建立TE13R120细胞后，进行克隆形成实验拟合细胞存活曲线，计算TE13及TE13R120细胞放射敏感性参数D0、Dq、N值和SF2，TE13细胞分别为:2.242、0.854、1.465、0.538;TE13R120细胞分别为:2.499、1.991、2.219、0.734。<br>　　倒置显微镜下观察对数生长期的单层细胞TE13细胞株和TE13R120细胞株形态学差异，TE13细胞株为不规则的多边形，细胞间边界不清，呈片状生长;而TE13R120细胞株则细长呈梭行或纺锤形，细胞极性消失。Western blot检测EMT相关标志物E-cadherin、Vimentin的蛋白表达情况，TE13细胞组的E-cadherin表达（403.526±32.684）高于TE13R120细胞组（132.291±6.542）(P＜0.05);TE13细胞组的Vimentin表达（86.438±4.387）低于TE13R120细胞组（400.324±5.698）(P＜0.05)。Real-Time PCR检测EMT相关标志物E-cadherin、Vimentin的mRNA表达情况。TE13细胞组的E-cadherin表达（1.576±0.290）高于TE13R120细胞组（0.095±0.052）(P＜0.05);TE13细胞组的Vimentin表达(1.015±0.236)低于TE13R120细胞组（23.145±1.131）（P＜0.05）。<br>　　2.TGF-β1诱导食管鳞状细胞癌细胞株TE13细胞发生EMT<br>　　取对数生长期的单层细胞于倒置显微镜下观察，TGF-β1(10ng/ml)刺激TE13细胞株48h后发生的形态学改变，细胞由不规则的多边形转变为纺锤形;细胞间的结合由紧密变为疏松。Western blot检测EMT相关标志物E-cadherin、Vimentin的蛋白表达情况，TE13细胞组的E-cadherin表达（403.526±32.684）高于EMT细胞模型组（156.369±5.722）(P＜0.05);TE13细胞组的Vimentin表达（86.438±4.387）低于EMT细胞模型组（389.324±9.378）(P＜0.05)。Real-Time PCR检测EMT相关标志物E-cadherin、Vimentin的mRNA表达情况。TE13细胞组的E-cadherin表达（1.576±0.290）高于EMT细胞模型组（0.213±0.142）(P＜0.05); TE13细胞组的Vimentin表达（1.015±0.236）低于EMT细胞模型组(22.848±0.211)(P＜0.05)。<br>　　3.NRAGE在三组细胞中的表达情况<br>　　通过Real-Time PCR、Western blot、免疫细胞化学技术对NRAGE在TE13细胞组、EMT细胞模型组、TE13R120细胞组中的表达情况进行检测。Real-Time PCR检测NRAGE的mRNA表达情况，TE13细胞组（1.6826±0.749）分别低于EMT细胞模型组(5.253±0.916)(P＜0.05)和TE13R120细胞组（5.562±2.212）(P＜0.05);EMT细胞模型组与TE13R120细胞组之间无差别(P＞0.05)。Western blot检测NRAGE的蛋白表达情况，TE13细胞组(34.408±3.267)分别低于EMT细胞模型组（160.327±15.797）（P＜0.05）和TE13R120细胞组(163.472±13.583)(P＜0.05);EMT细胞模型组与TE13R120细胞组之间无差别(P＞0.05)。进一步运用Western blot检测NRAGE在胞浆和胞核中蛋白表达情况。通过对三组细胞胞浆中NRAGE蛋白表达情况进行两两比较，三者比较均无差别(P(TE13 VS.EMT)＞0.05、P(TE13 VS.TE13R120)＞0.05、P(TE13R120 VS.EMT)＞0.05);两两比较在胞核中表达情况是否存在差别:TE13细胞组（45.384±3.680）分别低于EMT细胞模型组（198.345±26.265）和TE13R120细胞组（210.589±30.211），且均具有统计学意义(P(TE13 VS.EMT)＜0.05、P(TE13 VS.TE13R120)＜0.05），EMT细胞模型组与TE13R120细胞组间则无统计学意义(P＞0.05)。免疫细胞化学检测NRAGE在三组细胞中定位及胞浆胞核表达情况，三组细胞胞浆中的表达情况无明显差别(P(TE13 VS.EMT)＞0.05、P(TE13 VS.TE13R120)＞0.05、P(TE13R120 VS.EMT)＞0.05)，胞核中EMT细胞模型组和TE13R120细胞组表达明显多于TE13细胞组(P(TE13 VS.EMT)＜0.05、P(TE13 VS.TE13R120)＜0.05)，而EMT细胞模型组和TE13R120细胞组间则无明显差别(P＞0.05)。<br>　　结论:<br>　　1.NRAGE亚细胞定位参与放射抗性的形成;<br>　　2.EMT参与NRAGE亚细胞定位从而促进放射抗性的形成。