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摘要Dhhc2是dhhc分子家族的一员，该分子家族由一类具有特征性Asp-His-His-Cys(dhhc)结构域的蛋白分子组成，广泛存在于低等如酵母菌，高等如人类的各级生物体内。由于dhhc结构域的存在，大多数dhhc家族蛋白分子有棕榈酰转移酶的活性，是目前为止少数确定的棕榈酰化修饰酶。<br>　　蛋白质生物活性的获得需要经历复杂的蛋白质翻译后修饰，主要包括磷酸化修饰、糖基化修饰、泛素化修饰、脂质化修饰等。其中，脂质化修饰包括棕榈酰化修饰，豆蔻酰化修饰，异戊二烯化修饰等，其中棕榈酰化修饰是最普遍的，而且是唯一可逆的翻译后脂质化修饰，蛋白质经棕榈酰化修饰后疏水性增加，对脂质的亲和力增强。因此棕榈酰化修饰对于蛋白质翻译后的转运，膜定位及最终功能活性的获得由必不可少的意义。<br>　　棕榈酰化修饰在脑中的发生比例远远高于身体的其他组织器官，可能与脑内脂质成分丰富有关。由于dhhc家族分子普遍具有棕榈酰转移酶活性，因此该家族的多种成员被发现与大脑的功能执行及疾病发生有必不可分的作用，如dhhc17，即hip14。我们在以斑马鱼为模型进行的研究中发现，大多数的dhhc蛋白分子，包括dhhc2在内，都在斑马鱼卵的早期发育(0～72hpf)过程中大量表达于神经系统，因此我们推测该家族分子可能在斑马鱼的神经发育过程中起到重要的作用。<br>　　Dhhc2作为dhhc家族的一员同样具有棕榈酰转移酶活性，已有研究表明在神经系统中，dhhc2以psd95，gap43为棕榈酰化的底物对神经元的突触活动进行调节，此外该分子还被发现表达于多种组织肿瘤中调节ckap4等分子的表达。但该分子在神经系统发育过程中的具体作用及机制则没有相关的研究及报道。<br>　　本研究在斑马鱼这一动物模型的基础上，通过在斑马鱼胚胎1～4细胞期注射dhhc2吗啉反义寡聚核苷酸(mo)特异性的抑制dhhc2的表达进而研究其在斑马鱼胚胎发育过程中起到的作用及相关的机制。<br>　　为了研究dhhc2分子在斑马鱼胚胎发育过程中的作用，我们首先采用胚胎整封原位杂交和RT-PCR的方法，检测dhhc2基因在斑马鱼发育早期的时空表达。结果显示，除4细胞期有明显母源性表达外，由1000细胞期到尾牙期dhhc2在斑马鱼胚胎中几乎不表达，至18hpf开始表达量开始明显升高并维持高水平表达，且dhhc2在斑马鱼卵中的主要表达位置为中后脑区域。<br>　　随后，我们采用在斑马鱼胚胎早期（1～8细胞期）显微注射mo的方法，特异性抑制dhhc2蛋白的表达，并观察胚胎发育。结果发现，dhhc2表达抑制后的斑马鱼卵于18hpf及之前的发育时期并未表象出明显表型异常，从24hpf开始，mo注射组的斑马鱼胚胎和对照组斑马鱼胚胎相比中后脑区域出现明显的畸形。随后我们检测了端脑标记基因foxg1、中脑标记基因pax2.1、后脑第三第五菱脑节标记基因krox2.0及后脑菱脑节分界区标记基因rfng。结果证明，krox2.0在dhhc2 mo注射后表达明显减少，而菱脑节分界区标记基因rfng则有明显的异位表达。表明抑制dhhc2表达后，斑马鱼胚胎的后脑发育出现缺陷。<br>　　为进一步明确斑马鱼后脑发育异常的原因，我们检测斑马鱼胚胎后脑中神经元前体细胞标记物neurod4及胶质细胞标记物gfap的表达。结果显示，在以mo抑制dhhc2表达后，原本子斑马鱼后脑菱脑节中心部位表达的gfap表达范围缩小，而neurod4表达范围增大。由此可见，dhhc2蛋白调控了斑马鱼后脑的神经元发生及胶质发生。<br>　　为了探索dhhc2表达抑制后斑马鱼菱脑节胶质细胞发生范围缩小及神经元发生范围扩大的原因。我们检测了调控菱脑节中心区域胶质细胞发生的两个主要效应基因cyp26b1和sox9b的表达状况。RT-PCR和原位杂交结果表明cyp26b1的表达量及表达位置在mo注射前后无明显改变，而sox9b的表达量则在dhhc2表达抑制后明显降低。因此，我们推断，dhhc2表达抑制引起sox9b的表达降低进而使得后脑的神经元发生和胶质细胞发生出现异常，引起后脑的畸形。为验证这个猜想，我们合成了sox9b的mRNA并注射于dhhc2 mo组的斑马鱼卵中，并于28hpf比较观察对照组，dhhc2表达抑制组，sox9b和mo共注射组的斑马鱼胚胎后脑表型，结果证明，sox9b mRNA的注射成功挽救了dhhc2表达抑制引起的斑马鱼后脑畸形，同样，在sox9bmRNA注射后，后脑区域krox2.0及rfng的表达趋于正常。以上证据证明，sox9b的表达降低是dhhc2 mo注射后产生后脑发育畸形的主要原因。<br>　　已有研究证明，cyp26b1和sox9b的表达受fgfr2下游信号的调控，经典的fgf受体下游的信号通路包括fgf-erk，fgf-jrnk，fgf-p38信号通路;已有实验证明，fgf-erk信号调节cyp26b1的表达而对sox9b的表达无影响;鉴于在本实验中cyp26b1未有明显变化，我们主要检测了另外两条信号通路---fgf-jnk及fggp38。我们选取14hpf,20hpf,28hpf斑马鱼胚胎，采用western blot检测了不同处理组β-actin，jnk，p-jnk，p38，p-p38的表达水平。发现p-p38水平则在dhhc2 mo注射组明显降低，p-p38/p38比值下降。以上结果说明dhhc2的表达抑制干扰了p38的磷酸化水平。<br>　　以p38磷酸化激活剂anisomycin处理mo注射组鱼卵后，随着p38磷酸化水平的提高，sox9b表达下降现象减轻，相应的斑马鱼胚胎的表型也接近正常。<br>　　通过以上实验，我们证实了dhhc2可能通过促进fgf-p38信号通路的活化从而调节sox9b的表达，最终影响斑马鱼后脑发育过程中的神经元与胶质细胞发生。Dhhc2在斑马鱼后脑发育过程中起到不可缺少的作用。