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摘要幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，H.pylori）是人类消化道疾病、特别是胃部疾病最主要的致病菌之一，为革兰阴性螺旋形微需氧菌，其长期定植于人类胃粘膜，世界范围内的感染率达已达到50％。现已证实，诸如消化性溃疡、慢性胃炎、胃粘膜相关淋巴样组织(MALT)淋巴瘤甚至胃癌等多种胃肠道疾病的发生皆与H.pylori感染密切相关。Ⅰ型H.pylori菌株因携带cag致病岛(cag pathogenicityisland，cag PAI)而致其毒性较强。H.pylori重要的毒力因子:细胞毒素相关基因A蛋白(Cytotoxin-associated gene A，CagA)由cag致病岛编码的Ⅳ型分泌系统转运进入宿主细胞内，使其功能紊乱。研究至今，已经可以确定cag致病岛中含有27个基因，并且世界范围内的专家学者们对其进行了全面的探索研究，但时至今日仍有大部分基因与其编码的蛋白质的功能及其致病机理尚未完全明确。本文以cag致病岛中的cagS基因作为研究对象，通过微生物学、免疫学和分子生物学等技术探讨其功能，为进一步研究cag致病岛的致病机制和功能奠定基础。<br>　　方法:<br>　　1.H.pylori26695全基因序列来自于Genbank，经生物信息学软件:SignalP4.1 server对其信号肽进行预测分析，使用Primer Premier6.0设计去信号肽后的cagS基因引物，并构建原核表达载体pET-30a-cagS，转化入表达工程菌Rosetta(DE3);经IPTG诱导后，确定蛋白可溶性，大量诱导后，使用QIAGEN系统Ni2+-NTA柱纯化目的蛋白。并进一步通过复性浓缩，获得具有蛋白功能的CagS融合蛋白。使用SDS-PAGE电泳、Western blot等技术分析和鉴定目的蛋白。<br>　　2.将纯化后的CagS融合蛋白免疫小鼠，制得鼠抗CagS多克隆抗血清，利用酶联免疫吸附试验测定抗血清效价。<br>　　3.利用同源重组原理，设计PCR引物并扩增cagS基因上下游同源臂片段，构建cagS基因缺陷自杀质粒pBlueM40-△cagS::kan，通过电转化使其进入H.pyloriNCTC26695中，通过抗性筛选出阳性克隆，并使用PCR方法、基因测序方法以及Western blot分析验证后，即获得cagS基因缺陷株，并以野生株为对照，对其生长情况与尿素酶的分泌功能进行检测。<br>　　4.收集并裂解菌体，采用超高速低温离心法进行亚细胞分离，包括膜蛋白（包括内膜和外膜）、胞质蛋白及周质间隙蛋白，利用Western Blot技术，以鼠抗CagS多克隆抗血清为一抗，检测CagS蛋白亚细胞定位。<br>　　5.将cagS基因缺陷株与NCTC26695野生株分别与胃上皮细胞GES-1共培养后，分别提取细胞与细菌mRNA，对细胞IL-8以及细菌cagA的表达量进行检测;提取细胞蛋白，检测CagA蛋白转运量，研究cagS基因缺陷对CagA蛋白转运的影响;收集培养液上清，对细胞的IL-8分泌量进行检测。<br>　　6.收集cagS基因缺陷株与NCTC26695野生株，裂解后得到细菌全菌蛋白，使用Western blot方法分别检测cag致病岛重要编码蛋白Cagξ、CagX、CagM、CagL和CagI的表达量，研究cagS基因的缺失是否会对这些蛋白的合成与稳产生影响。<br>　　7.利用细菌双杂交体系，寻找cag致病岛中与cagS基因有相互作用的可疑基因。<br>　　结果:<br>　　1.H.pylori NCTC26695菌株cagS基因全长为591bp，其相对分子质量约为21kDa。预测该蛋白存在信号肽，位置在N端的前21个碱基，在21至22的位置处断裂。<br>　　2.成功构建原核表达载体pET-30a-cagS，通过原核表达，获得大量目的蛋白CagS。并通过QIAGEN系统纯化目的蛋白并免疫小鼠并制备鼠抗CagS多克隆抗血清，效价为1∶51200。<br>　　3.成功构建cagS基因敲除重组自杀质粒:pBlueKM40-△cagS::kan。通过电转化技术使自杀质粒进入H.pylori NCTC26695菌体内，并利用卡那霉素抗性筛选出同源重组成功的菌株，即为H.pylori cagS基因缺陷株:△cagS。通过酶切验证、PCR以及对PCR产物进行测序的方法进行了验证。<br>　　4.以鼠抗cagS多克隆抗血清为一抗作Western blot分析，确定CagS位于菌体膜部分;H.pylori与GES-1细胞共培养，检测cagA mRNA表达量与CagA蛋白转运量，结果显示cagS基因缺陷株的cagA mRNA表达量与CagA转运量与野生株无异，同时检测细胞的IL-8mRNA表达量与IL-8的分泌量，结果显示cagS基因缺失株诱导IL-8表达与分泌的能力明显下降;比较H.pylori野生株和cagS基因缺陷株中五种已知Cag-T4SS重要的结构蛋白的表达量。结果显示CagI、CagX、CagM、CagL和CagI蛋白表达水平没有明显差异。<br>　　结论:<br>　　1.成功构建了cagS基因原核表达载体pET-30a-cagS，并获得目的融合蛋白CagS，免疫小鼠后，获得了鼠抗CagS蛋白的多克隆抗血清。<br>　　2.成功构建了自杀质粒pBlueKM40-△cagS::kan，并且获得了一株cagS基因缺陷株△cagS。<br>　　3.初步确定了CagS蛋白的亚细胞定位，位于菌体膜部位;证明了cagS基因缺失并不会影响H.pylori cagA mRNA的表达，也不影响其CagA蛋白转运的能力;证明了cagS基因的缺失会降低H.pylori诱导宿主细胞表达及分泌IL-8的能力;证明了cagS基因缺失对Cagl、CagM、CagL、CagX和CagI这五种Cag-T4SS重要的结构蛋白的表达和稳定没有影响。