检索历史 清除

摘要研究背景钩端螺旋体病是一种世界范围传播的动物源性疾病，其病原体为钩端螺旋体（简称钩体），属于钩端螺旋体属。除了南极洲外，几乎所有的洲均发现了该病原菌的存在，尤其是热带和亚热带国家。啮齿类动物、猪和狗等是其主要的储存宿主。钩体可通过这些宿主的尿液排到外界，人类主要通过接触这些污染的水源和土壤而引起急、慢性感染，临床症状表现为轻微的“流感样”症状到严重的肺部出血和肾功能衰竭，直至死亡。目前问号状钩端螺旋体至少可分为25个血清群、260多血清型，我国已发现了19个血清群、161个血清型。<br>　　在钩体感染的早期，机体的天然免疫在清除钩体的过程中发挥了重要作用，钩体可被组织或血液中的单核-巨噬细胞所吞噬。研究发现，巨噬细胞的模式受体—清道夫受体A(scavengerreceptor，SR-A)在机体抗外来微生物的感染过程中发挥了非常重要的作用。LPS、脂蛋白和磷壁酸等细菌组分或完整的细菌均可以与SR-A相互作用。然而，至今未见钩体与巨噬细胞SR-A相互作用的研究报道。<br>　　研究方法本课题主要以原代小鼠巨噬细胞、鼠巨噬细胞系和问号钩体56606v株为主要研究对象，研究钩体56606v株与巨噬细胞相互作用过程中，是否通过SR-A被巨噬细胞所识别、粘附和吞噬，寻找钩体何种组分参与了SR-A作用以及SR-A和细胞因子mRNA表达量的变化，探究钩体与SR-A作用后吞噬途径。步骤如下:首先，Real-time PCR检测钩体感染原代和传代鼠巨噬细胞后，SR-A及IL-6、TNF-α和IFN-β1 mRNA的变化。其次，通过特异性化学抑制剂polyⅠ和SR-A单克隆抗体(2F8)抑制原代鼠腹腔巨噬细胞和RAW264.7细胞，流式细胞仪检测巨噬细胞粘附吞噬钩体比率。第三，将鼠SR-AⅠ和SR-AⅡ连接pDS-Red2-N1上，转染至非吞噬细胞—中国仓鼠卵巢细胞CHO-K1，G418筛选出高表达的pDS-Red2-N1-SR-A-CHO-K1稳转细胞株。将稳转细胞株与钩体56606v株相互作用，检测其粘附吞噬钩体情况。第四，应用SR-A基因敲除小鼠腹腔巨噬细胞与钩体相互作用，检测细胞粘附吞噬钩体的变化，确认SR-A介导钩体进入巨噬细胞，激活机体的天然免疫系统。<br>　　另外，热酚水法提取并纯化钩体LPS，鲎试验对其定量后，用不同浓度的钩体LPS刺激SR-A转染的CHO-K1细胞，流式细胞仪检测钩体LPS刺激后的pDS-Red2-N1-SR-AⅠ/Ⅱ-CHO-K1对FITC标记的beads吞噬情况。同时，将纯化后的钩体LPS刺激原代和传代鼠巨噬细胞，Real-timePCR检测SR-A及IL-6、TNF-α和IFN-β1 mRNA的变化。<br>　　最后，通过Pull down方法检测钩体感染pDS-Red2-N1-SR-AⅡ-CHO-K1后，细胞GTPase Rac和GTPase Cdc42蛋白活性的变化，探究钩体、SR-A和Rac/Cdc42吞噬作用途径。<br>　　结果 Real-time PCR检测到钩体56606v株感染RAW264.7细胞后，SR-A和IL-6 mRNA表达显著增加。用原代鼠腹腔巨噬细胞替代RAW264.7细胞，也可得到相同的实验结果，暗示着在钩体感染过程中，SR-A可能参与了巨噬细胞的吞噬作用和机体的炎症反应。用特异性化学抑制剂PolyⅠ和SR-A单克隆抗体作用于巨噬细胞;结果显示，在缺乏血清补体调理的情况下，两者均能有效抑制小鼠巨噬细胞吞噬CFSE标记的钩体，尤其是对4％多聚甲醛灭活的钩体，抑制作用则更为明显，抑制率最高可达50％左右。通过将鼠SR-AⅠ/Ⅱ连接到pDS-Red2-N1真核表达载体，并转染至非吞噬细胞CHO-K1，G418筛选后得到了稳转细胞株。流式细胞仪检测结果表明，同pDS-Red2-N1-CHO-K1相比，pDS-Red2-N1-SR-A-CHO-K1能显著增加粘附吞噬钩体比率(P＜0.05），pDS-Red2-N1-SR-AⅠ-CHO-K1和pDS-Red2-N1-SR-AⅡ-CHO-K1粘附吞噬钩体比率无明显统计学差异(P＞0.05）。为确证上述实验结果，我们应用SR-A基因敲除的小鼠腹腔巨噬细胞粘附吞噬钩体，同样证实了SR-A-/-巨噬细胞粘附吞噬钩体的比率低于正常对照组，有显著统计学差异(P＜0.05）。<br>　　热酚水法提取并纯化钩体LPS经考马斯亮蓝及银染染色，未见明显的细菌蛋白杂带，且LPS大小位于15kDa-25kDa之间。提纯的钩体56606v株LPS定量检测后，不同浓度钩体LPS(250ng/ml和500ng/ml)刺激pDS-Red2-N1-SR-AⅠ/Ⅱ-CHO-K1，能显著增加细胞对Latex beads吞噬能力。用钩体LPS刺激原代鼠腹腔巨噬细胞和RAW264.7细胞，均可检测到SR-A mRNA有显著增加，且有一定剂量依赖性。同时，IL-6、TNF-α和IFN-β1等重要细胞因子mRNA显著增加。<br>　　Pull down检测结果表明，钩体感染pDS-Red2-N1-SR-AⅡ-CHO-K1后，细胞GTPase Rac和GTPase Cdc42蛋白表达增加，而对照组未见明显变化。<br>　　结论小鼠巨噬细胞能通过SR-A粘附吞噬钩体56606v株;SR-A在巨噬细胞与钩体作用过程中主要发挥吞噬功能。钩体LPS能够被SR-A识别结合，且能够刺激巨噬细胞SR-A mRNA表达增加，IL-6、TNF-α和IFN-β1等细胞因子mRNA出现不同程度的变化。钩体感染细胞后，GTPaseRac和GTPase Cdc42蛋白表达增加。这些结果表明在钩体感染过程中，巨噬细胞通过SR-A粘附吞噬钩体并激活下游的Rac和Cdc42吞噬途径。钩体LPS参与了SR-A的识别结合作用，激活了机体的天然免疫和炎症反应等过程。实验结果对于深入研究钩体进入宿主以后，机体如何防御钩体感染和发挥天然免疫作用有非常重要的意义。同时，也有助于我们进一步了解钩体的致病机制、机体的免疫应答（包括天然免疫应答和获得性免疫应答）以及为钩体疫苗分子研究和药物作用靶标筛选提供了可靠的实验基础和理论依据。