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摘要课题一、Tsc1是维持巨噬细胞生存和功能的主要调节子<br>　　背景:结节硬化复合物1(Tsc1)和结节硬化复合物2(Tsc2)结合形成一个复合物，这个复合物可以通过哺乳动物雷帕霉素靶蛋白1(mTORC1)来调节细胞代谢和能量的稳定，TSC1和TSC2功能的丢失可引起mTORC1活性的升高，进而引起细胞体积增大、增殖能力增强。有研究称Tsc1调节巨噬细胞M1/M2的极化，但对于Tsc1对巨噬细胞的功能和自稳的精确调控作用尚不明确，本研究我们揭示Tsc1对于调节巨噬细胞的生存、生长、迁移和吞噬功能具有十分重要的作用。<br>　　材料与方法:我们将由Lysozyme启动子控制表达Cre重组酶的LysMCre鼠与Tsc1 flox/flox鼠交配获得髓系细胞特异性的Tsc1条件性敲除鼠（LysMCreTsc1 flox/flox）;PCR鉴定鼠的基因型，westem blot鉴定鼠巨噬细胞Tsc1蛋白的敲除情况;巨噬细胞的凋亡和生长由流式细胞术、RT-PCR进行检测;巨噬细胞精氨酸酶活化由QuantiChromTM arginase assay kit进行检测;M1和M2相关的基因的mRNA的表达由RT-PCT进行检测;巨噬细胞对T细胞活化的功能通过CD4+T细胞和巨噬细胞体外共培养3天后CD4+T细胞的活化进行鉴定;巨噬细胞的吞噬功能由VybrantTMphagocytosis assay试剂盒进行检测;巨噬细胞的迁移由Transwell实验进行检测;脾脏细胞和淋巴结细胞Foxp3的染色是通过Treg检测试剂盒进行。<br>　　结果:Tsc1 KO鼠巨噬细胞凋亡增加、细胞变大，腹腔注射Rapa可部分抑制Tsc1缺陷引起的巨噬细胞的凋亡和细胞生长;在稳定和炎症状态下，Tsc1缺陷的巨噬细胞在稳定和诱导作用下M1和M2特性均较WT巨噬细胞高，抑制mTORC1部分逆转了Tsc1缺陷引起的巨噬细胞的M2和M1的变化;Tsc1缺陷的巨噬细胞CCR2和CCR5趋化受体表达降低、迁移能力下降、趋化因子升高，抑制mTORC1部分逆转了Tsc1缺陷引起的巨噬细胞的趋化因子和趋化受体的变化;另外，Tsc1缺陷的巨噬细胞的吞噬能力和产生活性氧(ROS)的能力增加;与Tsc1缺陷的巨噬细胞共培养的CD4+T细胞的增殖和活化功能减弱。<br>　　结论:<br>　　1) Tsc1促进巨噬细胞的生存、抑制巨噬细胞的凋亡，并且这两种作用是与mTORC1的活性有关。CD71和CD98可能参与了Tsc1调节的巨噬细胞的生长;<br>　　2) Tsc1促进巨噬细胞M1和M2的特性，Tsc1缺陷的巨噬细胞在稳定状态下，分别增高了M1和M2的特性。在LPS和IL-4刺激下，Tsc1缺陷的巨噬细胞分布增高了M1和M2的极化特性;<br>　　3) Tsc1促进巨噬细胞的迁移，Tsc1缺陷的巨噬细胞的CCR2和CCR5的趋化受体表达降低，CCL2趋化引起的迁移能力降低。另外，Tsc1缺陷的巨噬细胞趋化因子表达升高。Tsc1抑制巨噬细胞的吞噬和ROS的产生，促进CD4+T细胞的活化;<br>　　4) Tsc1 KO鼠引起自发的淋巴组织增生性的疾病。脾脏和淋巴结增大，CD4+T细胞和CD8+T细胞活化严重。另外，鼠的体重没有明显的变化。<br>　　课题二全反式维甲酸促进多能干细胞向间充质干细胞样细胞分化<br>　　目的:多能干细胞包括胚胎干细胞(ES)和诱导多能干细胞(iPS)，作为一类具有无限自我更新和多向分化潜能的细胞群体，能进一步分化为多种类型的细胞。MSC临床应用前景广阔，是细胞替代治疗和组织工程的首选种子细胞，是移植领域和自身性免疫疾病治疗的研究热点。探索全反式维甲酸(RA)和SB431542对胚胎干细胞(ES)和诱导多能干细胞(iPS)分化为间充质干细胞(MSC)样细胞的影响。<br>　　方法:将培养的鼠ES和iPS根据不同的分化条件分为对照组、SB431542组及RA组不同浓度组，对照组为DMEM完全培养基，SB431542组为DMEM完全培养基中含10μM的SB431542，RA组的DMEM完全培养基中含RA浓度分别为0.05、0.10、0.20、0.40 nM。分化培养4d后观察细胞形态，流式细胞术检测细胞表面标志物CD105和干细胞抗原1（Sca-1）的表达，以CD105+细胞和Sca-1+细胞的比例确定iPS和ES向MSC分化的程度。<br>　　结果:<br>　　1)小鼠ES和iPS在ESGRO-2i培养基里生长较好。ES分化4d后，对照组和SB431542组ES和iPS分化成内皮样细胞，在含有不同浓度RA的培养基中ES和iPS可有效分化为纤维状细胞;<br>　　2)ES分化4d后，SB431542组Sca-1+细胞比例显著高于对照组(P＜0.05)，CD105+细胞比例与对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。在RA浓度为0.05、0.10、0.20、0.40 nM组中，ES分化的CD105+细胞比例显著高于对照组和SB431542组(P＜0.05)，Sca-1+细胞比例显著高于对照组(P＜0.05)，但与SB431542组比较显著降低(P＜0.05); RA浓度为0.20 nM组的CD105+和Sca-1+细胞比例显著高于RA浓度为0.05、0.10、0.40 nM组(P＜0.05);<br>　　3)iPS分化4d后，SB431542组CD105+细胞和Sca-1+细胞比例显著高于对照组(P＜0.05)。在RA浓度为0.05、0.10、0.20、0.40 nM组中，iPS分化的CD105+细胞比例显著高于对照组和SB431542组(P＜0.05)，Sca-1+细胞比例显著高于对照组(P＜0.05)，但与SB431542组比较均显著降低(P＜0.05); RA浓度为0.20 nM组Sca-1+细胞比例显著高于RA浓度为0.05、0.10、0.40 nM组(P＜0.05)，RA浓度为0.20 nM组CD105+细胞比例显著高于RA浓度为0.05、0.10 nM组(P＜0.05)，但与RA浓度为0.40 nM组差异无统计学意义(P＞0.05)。<br>　　结论:利用RA可以促进多能干细胞向MSC样细胞分化，分化方法较为简单，分化周期较短，为多能干细胞向MSC样细胞的分化提供了一定的方法基础。