换一批
换一批摘要该论文的主要工作有:1.以人的红血球白细胞cDNA文库为模板,根据报道序列设计引物,优化PCR条件,体外扩增Epl基因.将这一基因分别构建到载体pCR2.1 T vector和M13mp18/mp19单链噬菌体载体上用以进行序列分析;2.对这一基因进行序列分析.结果发现有两个碱基与报道序列不一致,并导致所编码的两个氨基酸与报道不同;3.在该实验室中从同一株红血球白细胞的mRNA出发经反转录后拼加接头,自行构建了该细胞株的Marathon Ready cDNAs.以此Marathon Ready cDNAs为模板再次进行PCR并对所得的产物片段进行直接测序鉴定.测序结果与报道序列比较仍有上述两处不同一株红血球白证明这两处碱基差别并非是PCR掺入的错误;4.将上述所得的EP1基因克隆到哺乳动物真核表达载体pcDNA3.1上,并以此转染中国仓鼠卵母细胞CHO-K1;6.以人的脑海巴区cDNA文库为模板,根据报道序列设计引物,体外克隆了P2y-like受体基因;7.以人心Marathon Ready cDNAs为模板,根据报道序列设计引物,体外克隆了P2y7受体基因.序列分析发现有一个碱基与报道序列不一致,并导致所编码的氨基酸也与报道不同;8.为此改从人红血球白细胞cDNA库中进行该基因cDNA的扩增并对所得的PCR片段直接测序.测序结果与来自人心Marathon Ready cDNAs的克隆相同,证明这一碱基之所以与文献报道不同,并非来自PCR掺入的错误,也不是由于采用了人心Marathon Ready cDNAs作为模板的缘故;9.以PCR重复延伸法对该碱基进行定点突变,获得了与报道序列一致的P2y7基因的体外克隆.
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