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摘要生物制氢基于生物化学反应原理，在常温常压下，利用微生物自身产氢代谢系统或基因改良产氢代谢系统，以有机质或自由水为底物产生氢气。这种方式不仅能够在常温常压下进行，而且更加环保，消耗的能源也较少，是一种可持续生产氢气的方式。<br>　　论文主要研究含镍铁氢酶基因的重组大肠杆菌的构建及产氢能力。实验通过RCVBN培养液富集，采用平板筛选法，筛选沼泽红假单胞菌，并对筛选到的沼泽红假单胞菌进行16S rDNA分子学鉴定;根据GenBank上查找的沼泽红假单胞菌镍铁氢酶大小亚基基因序列，设计PCR引物，分别扩增镍铁氢酶大小亚基基因，即hupS和hupL，将PCR产物经电泳回收后，与克隆质粒pBM19-T载体进行连接，转化到大肠杆菌DH5α中，获得含有镍铁氢酶大小亚基基因的pBM19-T载体，进行测序，测序结果与GenBank上的同源序列进行比对;然后，实验分别设计含有限制性内切酶位点的镍铁氢酶大小亚基基因引物，经PCR扩增、双酶切实验后，与表达载体pETDuet-1进行连接，构建成含有镍铁氢酶大小亚基基因的双启动子表达载体pETD-SL。<br>　　实验选用大肠杆菌BL21(DE3)作为重组对象，将获得的双启动子表达载体pETD-SL转化到大肠杆菌中。挑取阳性克隆，进行PCR、限制性酶切验证，并测序保证序列的一致性。以含pETDuet-1质粒的大肠杆菌BL21(DE3)作为对照组，将重组大肠杆菌BH20用1mM的IPTG诱导产生重组蛋白，并利用SDS-PAGE电泳检测重组蛋白诱导情况。同时，利用氢氧化钠排水法收集对照组和重组大肠杆菌的气体组分，经过气相色谱分析气体样本组分，考察大肠杆菌是否产氢。<br>　　实验还考察了在不同条件下（即葡萄糖浓度、温度、pH），重组大肠杆菌产氢情况。<br>　　通过上述实验，我们得到以下结果:<br>　　(1)通过显微鉴定和16S rDNA鉴定，获得了一株沼泽红假单胞菌株。此菌为革兰氏阴性菌，在显微镜下呈杆状，有鞭毛。菌落在固体培养基上呈棕红色，呈规则圆形，直径约0.4-1.3 mm，表面湿润光滑且边缘整齐。经光谱分析，结果显示分离的沼泽红假单胞菌的特征吸收峰为380、592、806和875 nm。<br>　　(2)按照已知的镍铁氢酶大小亚基基因序列设计引物，经PCR扩增得到长度约为1400 bp、2000 bp的两个片段，经连接到测序载体上测序后，测序结果显示镍铁氢酶大小亚基基因所编码的蛋白质大小分别为65.5 kDa和42.7 kDa。将两段序列在GenBank上进行同源序列分析，分析比对结果显示所克隆的基因确为沼泽红假单胞菌的镍铁氢酶的hupS和hupL基因。克隆到的含有限制性内切酶位点的大小亚基克隆片段连接到双启动子表达载体pETDuet-1上，最终成功构建了沼泽红假单胞菌镍铁氢酶表达载体pETD-SL质粒。<br>　　(3)将重组质粒pETD-SL转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，并筛选出一株能够表达沼泽红假单胞菌镍铁氢酶并能够产生氢气的重组大肠杆菌BH20。产氢实验现象和气体组分分析表明，重组大肠杆菌BH20能够产生氢气，而实验对照组不能产生氢气。<br>　　(4)检测大肠杆菌BH20菌株在不同温度下的产氢效率，结果表明，当温度为35℃时，产氢量最高，达到115.8±1.0 mL，葡萄糖的消耗率约为61.9％。大肠杆菌BH20菌株在不同pH值下的产氢效率，结果表明，当pH值为6.5时，产氢量最高，达到115.8±1.0 mL，葡萄糖的消耗率约为63.0％。大肠杆菌BH20菌株在不同葡萄糖浓度下的产氢效率，结果表明，当葡萄糖浓度为2％时，产氢量最高，达到氢气的产量为105.3±2.4 mL，葡萄糖消耗率为63.1％。因此，大肠杆菌BH20的最适产氢条件为温度35℃，pH为6.5，葡萄糖浓度为2％。在最适条件下产氢量为122.9±2.4 mL，同时葡萄糖的总利用率约为5.3％。<br>　　论文利用基因工程技术，将获得沼泽红假单胞菌镍铁氢酶中hupS和hupL基因序列，借助双启动质粒载体pETDuet-1成功地转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，获得了一株重组大肠杆菌BH20。产氢实验结果表明重组大肠杆菌BH20能够产氢，说明pETD-SL载体能增强以甲酸代谢系统产氢的微生物的产氢能力，这为未来应用于提升含有甲酸代谢系统的微生物的产氢能力方面有很好的应用价值。