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摘要本实验室前期研究发现细胞周期不同阶段，粟酒裂殖酵母核糖体蛋白基因rpl32-2的表达水平是不断变化的，说明rpl32-2表达受到严密调控。进一步，以rpl32-2的上游启动子为诱饵通过酵母单杂交系统筛选到了粟酒裂殖酵母核糖体蛋白RPS601，推测RPS601可能是rpl32-2的一个转录调控因子，对rpl32-2进行着转录水平上的调控作用。本文首先通过EMSA（凝胶阻滞迁移率）实验从体外进行验证。首先构建并异源重组表达His标记的RPS601，经过Ni-NTA agarose纯化RPS601蛋白，并通过Western Blot进行验证;同时制备了荧光标记的rpl32-2上游5个长度为200bp的启动子片段，将标记的启动子片段与纯化的RPS601蛋白孵育处理，进行PAGE凝胶电泳，结果未出现蛋白RPS601与rpl32-2启动子片段相结合的滞后条带。其次进行CHIP-PCR（染色质免疫共沉淀）实验从体内作进一步验证。利用同源重组方法构建了His标记的RPS601和对G418具有抗性的酵母突变菌株SP-Q01S;对SP-Q01S细胞进行甲醛固定，解交联，超声剪切染色质等操作，采用anti-His免疫沉淀染色质上可能结合的RPS601-His蛋白，通过Protein G Agarose免疫沉淀anti-His与RPS601-His的复合物及与其相结合的染色质DNA片段，Western Blot确定了IP中RPS601-His蛋白，富集纯化DNA片段，以此为模板用采用特异性引物进行PCR扩增。结果显示实验中未扩增出目的基因片段rpl32-2上游启动子序列。以上EMSA和CHIP-PCR实验结果提示RPS601与rpl32-2没有相互作用，说明只通过单杂交筛选实验并不能确定蛋白和基因相互作用<br>　　本实验室前期通过比较野生型和过表达RPL32-2的粟酒裂殖酵母的基因转录组表达谱(Microarray)，发现粟酒裂殖酵母核糖体蛋白RPL32-2能够激活与细胞分裂至关重要的基因ace2，促进细胞的分裂，提示RPL32-2可能对ace2有转录激活作用。本文利用酵母单杂交筛选系统，构建了含有ace2上游启动子和报告基因的诱饵菌，同时构建了粟酒裂殖酵母野生菌株的cDNA文库，通过酵母单杂交筛选系统从cDNA文库中筛选ace2的转录因子，但在获得的阳性克隆中没有筛选到RPL32-2 cDNA的菌株，有可能是RPL32-2与ace2启动子没有相互结合作用。然而，本筛选系统筛选到了10种其他cDNA阳性克隆。这些cDNA编码蛋白是否为ace2潜在的转录因子，有待后续EMSA和CHIP-PCR等方法进一步验证。