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摘要Orexin(又称为hypocretin)是一类神经活性肽，包括orexin-A(hypocretin-1)和orexin-B(hypocretin-2)，它们分别含有33和28个氨基酸残基，由共同前体prepro-omxin经水解产生。Orexin通过与质膜上G蛋白偶联的特异性受体:orexin-1型受体(OX1R)和orexin-2型受体(OX2R)结合而发挥作用。在脑中，产生和分泌orexin的神经元特异地分布于下丘脑侧后部，并广泛投射至全脑。Orexin参与多种生理作用的调控，例如睡眠/觉醒、昼夜节律、神经元的放电、摄食行为等。然而，对这种调节肽在视网膜中的研究却基本上属于空白。唯一的工作显示，人的视网膜神经元表达orexin-A和orexin-B，但作者并未用免疫荧光双标检测这些神经元的细胞类型。<br>　　本文研究了orexin及其受体在大鼠视网膜各类细胞上的分布;并进一步研究了orexin-A对神经节细胞(ganglion cell，GC)上L型钙电流的调制作用及其机制。运用RT-PCR及免疫组化方法，我们的结果显示orexin及OX1R和OX2R的mRNA和蛋白均存在于大鼠视网膜中。Orexin-A和B的免疫荧光染色在内核层和神经节细胞层的许多细胞上可见。免疫双标实验显示，在外层视网膜，orexin-A和B表达在calbindin标记的水平细胞和homeobox protein Chx10标记的双极细胞上。在内层视网膜，orexin-A和B均表达在GABA能无长突细胞（amacrine cell，AC）上，包括酪氨酸羟化酶标记的多巴胺能AC和胆碱乙酰基转移酶标记的胆碱能AC上。甘氨酸能AC（包括AⅡ型AC）也表达这两种肽。此外，orexin-A和B在所有cholera toxin B(CTB)逆行标记的GC上也有明显表达。OX1R表达在大部分GC和多巴胺能AC上，并在两个网状层上也有弥散的分布。与之形成对照的是，在大鼠视网膜中未检测到明显的OX2R的免疫荧光染色。这些结果提示，orexin可能参与调节内层视网膜神经元的功能。应用全细胞膜片钳记录技术，在大鼠视网膜薄片上，我们首先鉴定了L型钙电流。在细胞外液中，用5 mM Ba2+取代Ca2+，并施加TTX、TEA分别阻断电压门控钠通道和非选择性钾通道，将细胞钳制于-40 mV，去极化到0 mV，引出内向电流，此电流可被L型钙通道特异性激动剂BayK8644增大，并能被L型钙通道特异性阻断剂nifedipine阻断。接着，我们进一步研究了orexin-A对GC上L型钙电流的调制作用。结果显示，orexin-A能显著增大L型钙电流，并能被洗回。当胞外给予OX1R特异性阻断剂SB334867时可取消orexin-A对L型钙电流的增大作用，而OX2R特异性阻断剂TCS OX229则没有作用，表明orexin-A对L型钙电流的调制作用经由OX1R介导。L型钙通道的激活和稳态失活均不受orexin-A的影响。<br>　　本文研究了orexin-A增大L型钙电流的胞内机制。胞内施加G蛋白抑制剂GDP-β-S后，orexin-A不再增大L型钙电流，提示G蛋白参与上述作用。磷脂酰肌醇磷脂酶C(phosphatidylinositol phospholipase C，PI-PLC)抑制剂U73122可明显减弱orexin-A的作用，而磷脂酰胆碱磷脂酶C(phosphatidylcholine phospholipase C，PC-PLC)抑制剂D609却不起作用。此外，胞内施加10 mM BAPTA使细胞处于Ca2+-free条件下，再施加orexin-A，作用消失，说明orexin-A的作用有胞内钙的参与。当给予xestospongin-C(XeC)或肝素（heparin）阻断IP3受体介导的钙库释放，orexin-A的作用消失，而胞内给予ryanodine阻断ryanodine受体介导的钙库释放，orexin-A仍能增大L型钙电流。因此，orexin-A增大L型钙电流依赖于IP3受体介导的胞内钙库释放Ca2+。L型钙电流的增大也可被蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)抑制剂bisindolymeleimideⅣ(BisⅣ)和G?6976所阻断。然而，蛋白激酶A(proteinkinaseA，PKA)抑制剂KT5720或激动剂cAMP和蛋白激酶G(protein kinaseG，PKG)抑制剂KT5823或激动剂cGMP均不影响orexin-A对GC上L型钙电流的增大作用。研究了orexin-A和B及其受体在大鼠视网膜上的分布，并进一步显示orexin-A与GC胞膜上的OX1R结合后，激活G蛋白/PI-PLC/IP3/Ca2+/PKC信号通路，进而增大GC的L型钙电流。