检索历史 清除

摘要目的:肺癌是全世界范围死亡率最高的肿瘤。近年来，靶向治疗成为肺癌研究的热点。越来越多分子靶点的发现及靶向药物的研发给肺癌患者长期生存带来了希望。但是，只有特定基因型的患者才能从相应靶向药物治疗中获益。因此，为使更多的患者从靶向治疗中获益，对非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)患者群体进行精确的分子亚型区分，成为了肺癌靶向治疗成功的重要条件。2012年研究发现肺癌中存在一种新的融合基因KIF5B-RET，其阳性患者多为不吸烟或很少吸烟的腺癌患者。其存在与其他已知的基因改变如EGFR、K-Ras、EML4-ALK等相互排斥，提示KIF5B-RET是一种新的致癌驱动突变，有可能成为非小细胞肺癌个体化诊断与治疗的一个分子靶点。KIF5B-RET融合基因的功能性研究目前尚不深入，其基因功能有待深入探讨。本研究主要应用慢病毒感染的手段构建KIF5B-RET融合基因阳性的稳定转染细胞株并初步探讨KIF5B-RET融合基因对细胞在增殖、迁移、凋亡方面的影响。<br>　　方法:本实验采用分段PCR法分别扩增出KIF5B基因片段和RET基因片段，分别载入载体质粒后，与pCDH-CMV-MCS慢病毒表达载体进行连接后获得载有完整KIF5B-RET基因片段的质粒，并进行慢病毒的包装和生产，转染BEAS2B肺上皮细胞后进行RT-PCR和Western blot鉴定获得稳定表达KIF5B-RET融合基因细胞株。采用CCK8及平板克隆形成实验检测细胞增殖能力，transwell法检测细胞迁移能力，AnnexinⅤ-FITC/PI双染法检测细胞凋亡，western blot检测信号通路蛋白激活及药物抑制情况。<br>　　结果: RT-PCR检测结果显示KIF5B-RET-PCDH（KV2亚型）及KIF5B-RET4-PCDH（KV4亚型）慢病毒转染BEAS2B细胞后两种KIF5B-RET融合基因mRNA表达明显，Western blot检测结果显示两种KIF5B-RET融合蛋白表达明显，说明BEAS2B-KIF5B-RET工具细胞构建成功。基因转染组在正常培养情况下对细胞增殖没有影响，但在减血清浓度(5％)的情况下增殖情况有差异。基因转染组与对照组相比迁移能力增强。在减血清及加入顺铂凋亡诱导剂的情况下实验组显示出抗凋亡的能力。Western blot结果显示多靶点酪氨酸激酶抑制剂阿帕替尼对KIF5B-RET蛋白具有抑制作用，并可以抑制其下游信号通路的激活。<br>　　结论:1.KIF5B-RET融合基因对细胞有抗凋亡的作用。<br>　　2.KIF5B-RET融合基因对细胞有促迁移的作用。<br>　　3.阿帕替尼对KIF5B-RET蛋白及下游信号通路有抑制作用。