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摘要本课题中采用豚鼠的形觉剥夺性近视(form-deprivationmyopia, FDM)模型，通过玻璃腔内注射PI3K/AKT通路特异性抑制剂LY294002阻断该通路以及玻璃腔内注射外源性Shh-N和特异性抑制剂cyclopamine以激活和抑制Shh的表达，观察实验动物眼轴、屈光度以及Shh、PI3K/AKT通路信号因子的变化情况，同时检测巩膜组织碱性成纤维细胞生长因子(basic FibroblastGrowth Factor，bFGF)、MMP-2等的改变，探索Shh信号因子对近视调控作用的中间通路和具体调控途径，建立完整的信号通路，为近视眼防治提供依据。<br>　　第一部分:豚鼠形觉剥夺性近视眼视网膜PI3K/AKT通路信号因子及巩膜<br>　　MMP-2等下游因子的表达变化<br>　　目的:在豚鼠形觉剥夺性近视模型(FDM)中检测视网膜PI3K/AKT通路信号因子的表达变化，观察巩膜中MMP-2和bFGF含量的改变。<br>　　方法:72只2-3周龄三色健康豚鼠随机分为FDM组(n=48)和空白对照组(control组)(n=24)。FDM组右眼眼周黏贴半透明薄膜，左眼及对照组不作任何处理。FDM组和对照组分别于形觉剥夺0周、1周、2周及4周各取6只豚鼠进行检影验光及眼轴长度等生物学测量后，处死取眼球行免疫荧光染色检测视网膜PI3K、AKT的表达水平，实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(real-time fluorescentquantitative reverse transcription polymerase chain reaction, real-time PCR)检测视网膜PI3K、AKT的mRNA水平变化，Western-blot检测视网膜PI3K、AKT蛋白表达水平及巩膜组织中bFGF、MMP-2的表达变化。<br>　　结果:三组豚鼠的前房深度、晶状体厚度比较差异无显著统计学意义。免疫荧光染色显示，PI3K、AKT弥漫表达于豚鼠视网膜各层。FDM组中遮盖眼PI3K、AKT的mRNA表达水平在第1周开始较对侧眼明显升高，在形觉剥夺4周时最为显著（P值分别为0.0052和＜0.001）。Western blot结果显示，形觉剥夺第2周开始，遮盖眼的PI3K、AKT蛋白表达水平开始较左眼显著升高，并持续至第4周;遮盖眼巩膜MMP-2在剥夺第2周后开始显著升高，而bFGF表达水平亦在形觉剥夺第2周显著上升，并持续至第4周。<br>　　结论:在半透明薄膜法诱导的豚鼠FDM中，视网膜组织PI3K、AKT表达水平升高，同时伴随巩膜组织bFGF、MMP-2表达的上升，提示PI3K、AKT信号通路可能参与了豚鼠FDM的调控过程。<br>　　第二部分:玻璃体腔内注射PI3K/AKT通路特异性抑制剂阻断PI3K/AKT通路对豚鼠近视发生发展的作用及相关机制研究<br>　　目的:通过豚鼠玻璃体腔内注射PI3K/AKT通路特异性抑制剂LY294002来观察阻断该通路后对豚鼠近视发生发展的作用及相关因子表达水平的变化。<br>　　方法:将出生2-3周龄三色健康豚鼠54只随机分为3组，每组18只。每组的右眼进行眼周黏贴半透明薄膜建立FDM模型，左眼作为自身对照（不予任何处理）。双眼同时进行LY294002玻璃体腔注射，每次在固定时间进行注射，隔1天注射一次，共注射3次，三组注药浓度分别为10M/L、20uM/L、40uM/L。分别在建模的第0、1、2、4周进行验光和眼轴等生物学测量后，处死取眼球视网膜组织行RT-PCR检测Shh通路信号因子的表达变化，取巩膜组织进行Western-Blot检测Shh、MMP-2和bFGF蛋白表达水平。<br>　　结果:在遮盖的第1，2，4周，3组玻璃体腔注药豚鼠中，三组间比较及与第一部分结果比较差异均有显著统计学意义（P＜0.05）。3组豚鼠右眼较对侧眼眼轴长度和玻璃体腔长度的延长比较以及和第一部分结果比较，差异均有显著统计学意义(P＜0.01)。三组豚鼠Shh的mRNA表达水平比较以及和第一部分单纯FDM引起的Shh的mRNA表达水平比较，差异均有显著统计学意义（P＜0.05）。Western-Blot结果显示，在FDM2周，三组间Shh蛋白的表达随注药浓度逐渐减少，且均少于第一部分的FDM2周水平;巩膜组织MMP-2蛋白的变化和Shh蛋白相同，但bFGF蛋白表达变化不显著。<br>　　结论:阻断PI3K/AKT信号通路后，豚鼠形觉剥夺所产生的近视有所抑制，表明PI3K/AKT信号通路可能是实验动物形觉剥夺性近视发生、发展的中间通路;PI3K/AKT信号通路抑制后，Shh信号因子mRNA表达的上调较单纯FDM引起的mRNA表达上调出现显著地延缓和抑制，且这种抑制作用和浓度呈正相关，表明PI3K/AKT可以反向作用于Shh信号通路，或者说Shh可以通过介导PI3K/AKT信号通路发挥作用。<br>　　第三部分:玻璃体腔内注射Shh-N溶液、FDM豚鼠玻璃体腔内注射Shh特异性抑制剂Cyclopamine对豚鼠形觉剥夺性近视发生发展的作用及相关机制研究<br>　　目的:分别在豚鼠玻璃体腔内注射Shh-N溶液激活Shh信号通路、在FDM豚鼠玻璃体腔注射Cyclopamine阻断Shh信号通路后观察两种干预方式对近视发生、发展的作用，同时检测PI3K/AKT通路信号因子以及下游巩膜中MMP-2及bFGF表达水平的变化，研究Shh通路和PI3K/AKT通路之间的交互对话，进一步探索Shh作用的中间通路和作用路径。<br>　　方法:分别将出生2-3周龄三色健康豚鼠48只随机分为2组(A)、72只分为3组(B)。三(A)的2组豚鼠分别进行右眼Shh-N溶液的玻璃体腔注射，左眼进行BSA的注射作为对照组。每次注射10μl，每次在固定时间进行注射，隔2天注射一次，共注射4次。两组的Shh-N注射浓度分别为20μg/ml和50μg/ml。在注药前及注药后2周进行验光和眼轴等生物学测量，处死取眼球取视网膜组织行PI3K/AKT信号因子的mRNA和蛋白检测，取巩膜组织进行Western-Blot检测MMP-2和bFGF蛋白表达水平。三(B)的三组豚鼠每组的右眼进行半透明薄膜遮盖，同时双眼进行相同浓度cyclopamine注射。双眼依次进行玻璃体腔内注射，隔2天注射一次，每次每只眼球注射10μl，共注射4次。3组的cyclopamine注药浓度分别为0μg/ml（溶剂，FDM0组）、50μg/ml（FDM50组）及200μg/ml（FDM200组）。在注药后的第2周进行观察检测，检测项目同三(A)。<br>　　结论:Shh信号通路激活、阻断后，实验动物眼屈光状态和PI3K/AKT通路的信号因子分别发生了相应的、且变化趋势一致的改变，说明Shh分子可能是通过介导PI3K/AKT信号通路作用于下游的因子，调控了近视的发生和发展。<br>　　第四部分:玻璃体腔内同时注射Shh-N溶液、PI3K/AKT通路特异性抑制剂LY294002对豚鼠近视发生发展的作用及相关机制研究<br>　　目的:通过豚鼠玻璃体腔内同时注射Shh-N溶液、PI3K/AKT通路特异性抑制剂LY294002来直接验证PI3K/AKT通路是否为Shh调控近视发生发展的唯一中间路径。<br>　　方法:将出生2-3周龄三色健康豚鼠48只随机分为2组，每组24只。每组的右眼进行Shh-N溶液和LY294002玻璃体腔注射，另一眼进行Shh-N溶液和LY294002溶剂（0.1％ BSA，牛血清蛋白）注射，两组Shh-N的注射浓度分别为25、50ug/mL，LY294002的注射浓度为40uM/L。每次在固定时间进行注射，隔1天注射一次，共注射4次.分别在注射的第14天（2周）进行验光和眼轴等生物学测量后，处死取眼球巩膜组织进行Western-Blot检测MMP-2和bFGF蛋白表达水平。<br>　　结果:两组豚鼠注药后左眼较右眼分别诱导出了-1.03±0.74D、-2.15±0.92D的近视;眼轴长度左眼较右眼延长了0.07±0.03mm、0.12±0.05mm;玻璃体腔长度延长了0.06±0.02mm、0.11±0.05mm;两组豚鼠左眼和第三部分中单纯注射Shh-N溶液相比较，差异无显著统计学意义（P＞0.05）;两组间比较，右眼的屈光度、眼轴长度、玻璃体腔长度差异无显著统计学意义(P＞0.05);右眼结果与第一部分空白对照组比较差异无显著统计学意义（P＞0.05）。Western-Blot结果显示，左眼巩膜组织中的bFGF、MMP-2蛋白表达较第一部分空白对照组显著上调，但右眼组间变化不显著。<br>　　结论:PI3K/AKT通路的特异性抑制剂可以阻断Shh-N所引起的豚鼠近视的发生和发展，且阻断效应与Shh-N注药浓度无关，说明PI3K/AKT通路可能是Shh信号调控近视发生发展的唯一中间通路和作用路径。