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摘要ARHI是一种抑癌基因，该基因在卵巢，乳腺等组织中有高表达，在很多正常组织中如心、脑、肝等器官中也有表达。但与之相反的是，在肿瘤细胞中ARHI的表达却很低，如在乳腺癌、卵巢癌、胃癌等。这种改变可能与DNA甲基化、杂合丢失和组蛋白异常乙酰化有关。但是ARHI在肾癌中的表达、作用和机制目前尚不明确。本次研究，我们通过细胞生物学和分子病理学方法探讨ARHI基因对肾癌增殖及凋亡的作用。<br>　　目的:检测肾脏肿瘤细胞和正常肾组织中ARHI的表达，了解ARHI的表达与肾癌的临床参数之间的相关性。检测ARHI在肾癌细胞系中的表达情况，并建立ARHI再表达的稳定转染细胞系。分析ARHI对肾癌细胞的增殖、凋亡的作用以及对细胞周期的影响。通过对相关信号通路的研究，探讨ARHI在肾癌细胞中的作用机制。<br>　　材料和方法:我们选取了52例肾癌的临床标本，患者来源于中国医科大学附属第一医院泌尿外科2009年1月至2013年12月就诊的肾透明细胞癌病例。手术切除患肾及肿瘤，留取肿瘤组织和癌旁正常肾组织标本进行研究。所有患者术后证实病理为肾透明细胞癌。通过RT-PCR和免疫印迹的方法检测肿瘤细胞和对应癌旁正常组织细胞的ARHI蛋白和mRNA的表达情况。搜集患者的年龄、性别、肿瘤大小、病理分级和TNM分期等资料，分析ARHI的表达与肾癌预后之间的关系。并根据患者的随访信息，绘制生存曲线图。通过免疫组化的方法确定ARHI在肾癌中的表达位置。培养肾癌ACHN，OS-RC-2，786-O，769-P细胞系，利用RT-PCR和免疫印迹的方法检测ARHI在肾癌各细胞系中的表达情况。选取ARHI表达量较低的细胞系进行进一步的功能实验。通过pcDNA3.1-ARHI质粒转染的方法建立ARHI过表达的肾癌细胞系。将细胞分为转染组，载体转染组和未转染组。通过MTT法检测ARHI对肾癌细胞增殖率的影响。利用PI染色法检测ARHI的表达对肾癌细胞周期的影响。通过PI/AnnexinⅤ双染法，检测各组细胞凋亡率的变化，从而说明ARHI对肾癌细胞凋亡的作用。最后，我们提取各组细胞的核蛋白和胞浆蛋白，通过免疫印迹的方法检测Wnt/β-catenin信号通路的相关蛋白表达，包括LRP6，P-LRP6，Axin2，GSK-3β，以及胞核和胞浆内的β-catenin，从而对ARHI的可能作用机制进行分析和探讨。<br>　　结果:我们对52例肾癌临床标本进行了免疫印迹和RT-PCR检测，发现，肿瘤组织中ARHI的表达水平明显低于癌旁正常肾组织。二者存在统计学差异(P＜0.05)。免疫组化结果发现，ARHI在肾脏细胞的表达主要在胞浆中。将52例病人分为ARHI阳性组和ARHI阴性组，发现ARHI阳性组中位生存时间明显高于ARHI阴性组。ARHI的表达与患者的年龄，性别，肿瘤大小，病理分级和淋巴结转移无关，而与肿瘤的T分期和M分期有关。在各肾脏肿瘤细胞系ARHI的表达量均较低，且无统计学差异(P＞0.05)。我们选取亚裔来源的细胞系OS-RC-2进行下阶段实验，经过转染后ARHI在OS-RC-2中的表达明显升高，mRNA的表达量是未转染组的8.05倍(P＜0.05)，而空载体转染组和未转染组无统计学差异(P＞0.05)。通过MTT法检测，pcDNA3.1-ARHI转染的OS-RC-2细胞的增值率得到明显的抑制，转染组细胞增值率为未转染组的0.46倍(P＜0.05)，未转染组与空载转染组和无统计学差异(P＞0.05)。各组OS-RC-2细胞通过AnnexinⅤ/PI双染后，流式细胞仪对细胞的凋亡情况检测。转染组凋亡细胞数量明显增加，是未转染组的7.67倍(P＜0.05)。而未转染组与空载体转染组无统计学差异(P＞0.05)。通过PI染色后，流式细胞仪进行检测。转染组中63.5％的细胞停留在G1期，未转染组与空载转染组G1期细胞比例为34.1％和32.8％。与之对应的，转染组G2期细胞比例仅为6.3％，而未转染组与空载体转染组G2期细胞比例分别为32.5％和36.4％。最后我们通过免疫印迹的方法对ARHI的作用机制进行研究，发现ARHI过表达后，OS-RC-2细胞胞浆和胞核内的β-catenin的表达受到抑制，未转染组和空载体转染组则没有统计学差异。为了说明ARHI的作用机制，我们还检测了与β-catenin信号通路相关的蛋白LRP6。转染组LRP6及磷酸化LRP6的蛋白表达同样得到抑制，而Axin2和GSK-3β的表达增加，上述结果与未转染组和空载体转染组相比均有统计学差异。<br>　　结论:在肾癌组织中，ARHI的表达比癌旁正常组织显著下降，而且ARHI的表达情况与疾病的预后相关。在肾癌细胞中，ARHI的再表达可以抑制肿瘤细胞的增殖，减少细胞的有丝分裂，并促进肿瘤的凋亡，对肿瘤的生长具有抑制作用。而这种作用很可能是通过Wnt/β-catenin信号通路实现的。