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摘要肿瘤发病率高、早诊率低，使得肿瘤患者5年生存率低，所以肿瘤诊治的关键在于早发现、早诊断、早治疗。mi-croRNA与多种肿瘤的发生、发展密切相关，它的作用靶点可以是抑癌基因，也可为癌基因，miRNA的多种作用可用于肿瘤的诊治。miRNA的种类较多，其中较为引人注目的是miRNAlet-7家族，它于2000年被发现，let-7家族在多种肿瘤中异常表达，并可参与调节恶性肿瘤细胞的增殖、侵袭转移以及抗凋亡机制。该家族共有13个成员:let-7a-1、let-7a-2、let-7a-3、let-7b、let-7c、let-7d、let-7e、let-7f-1、let-7f-2、let-7g、 let-7i、miR-202和miRNA-98。作为miRNA的一员也具有miRNA特征，有高度保守性、时序性、组织特异性，不仅受到发育和空间的调控，而且还参与细胞的分化、增殖、凋亡，参与多种肿瘤的发生、发展。多项研究表明let-7家族作为一种生物标记，在肿瘤中的表达水平也是肿瘤早期表现以及抗肿瘤治疗疗效评估的一个因素，因此这使let-7家族在临床筛查方面的应用成为可能。<br>　　肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是一种常见、死亡率高的恶性肿瘤，其发病率位于全球第4位，中国第2位。全球肝癌发病数为5614万人，其中55％的病人发生在中国，约3016万人。其在临床上恶性度较高、危害大，死亡率在消化道恶性肿瘤中排第三位。目前HCC的治疗多采用手术为主的综合模式，而手术切除癌肿只能让大约15％的HCC患者受益。由于缺乏可靠的检测标记物，大多数患者就诊时已届中晚期，失去了最佳治疗时机，预后较差。近年来，其它治疗方案如微创治疗、放化疗、分子靶向治疗和免疫治疗等已显示出良好的治疗效果。<br>　　磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(glypican-3，GPC3)是Pilia等于1996年发现的一种细胞膜表面的硫酸乙酰肝素糖蛋白，国内外研究基本一致认为，GPC3可以用于原发性肝癌(primary hepatic carcinoma，PHC)的诊断，甚至比经典的肝癌标志物甲种胎儿球蛋白（alpha-fetoprotein，AFP）还具有一定的优越性，PHC是最常见的消化系统恶性肿瘤之一，其按病理学分型可分为肝细胞型肝癌(HCC)、胆管细胞型肝癌及混合型肝癌，其中主要类型是HCC，占PHC的90％以上。<br>　　免疫治疗主要是通过从患者体内抽取部分免疫细胞，然后在其体外进行‘培养、诱导、激活’等一系列操作，使其抗肿瘤的活性大大提高后，再将其回输到病人体内，去杀灭肿瘤细胞。树突状细胞(Dendritic Cell，DC)是体内摄取、加工、呈递抗原的最重要的专职抗原呈递细胞，是唯一可以活化初始T细胞的抗原呈递细胞，是抗肿瘤主动免疫治疗的一种方法。免疫治疗方法的核心问题是如何提升效应细胞的功能和临床效果的评价。因此，本研究拟用GPC3去装修效应细胞以提高其靶向杀瘤功能;同时检测患者体内GPC3抗原的表达情况来评价临床疗效，探讨以GPC3作为HCC靶点的免疫治疗方法，从而推动HCC免疫治疗的发展，以造福于广大肝癌患者。<br>　　目的：<br>　　本研究第一部分通过目前荟萃分析判断let-7家族在肿瘤筛查中的作用。之后我们通过收集HCC患者和肝良性病变患者的组织标本和血清标本;收集乙型肝炎、丙型肝炎合并HCC患者、乙型肝炎、丙型肝炎合并肝硬化患者、单纯乙型肝炎、丙型肝炎患者血清标本;探讨它们血清和组织中GPC3蛋白表达的一致性和差异性，分析GPC3对HCC诊断的特异性和敏感性及与AFP互补诊断一致性和差异性。通过GPC3抗体筛查HCC患者GPC3蛋白表达阳性者，经血浆分离出GPC3抗原，处理后装修DC，观察体内外杀瘤效果;通过构建GPC3表位肽抗体、筛查长期HBsAg阳性未患HCC患者的GPC3抗体，装修CIK细胞，观察体内外杀瘤效果。为提高HCC的早期诊断率，建立以GPC3作为肝癌免疫治疗靶点的肝癌免疫治疗体系和疗效评价体系，提供理论及数据依据。<br>　　材料与方法：<br>　　荟萃分析中计算机检索国内外大型数据库，以获取2000年1月至2014年6月23日期间关于Let-7家族应用于肿瘤筛查的研究文献。依据纳入及排除标准筛选文献并提取数据，采用诊断准确性研究修订后的质量评估工具(QUADAS-2)对纳入研究进行严格的质量评价，然后进行异质性分析，根据异质性特点选择相应效应模型进行计算合并的敏感度、特异度、诊断比值比、阳性似然比和阴性似然比，绘制SROC曲线，并计算曲线下面积(AUC)。最后通过回归分析探讨可能的异质性来源。所有的统计学分析均通过Stata12.0软件完成。<br>　　论文二中收集组织标本，包括HCC患者组织标本，采用SP免疫组织化学法和荧光免疫组织化学染色法检测组织标本中的GPC3的表达情况，采用实时荧光定量聚合酶链反应(Real Time-PCR)检测GPC3基因在肝癌组织及癌旁肝组织中的表达;收集血清标本，包括单纯HCC患者、肝良性病变患者、乙型肝炎合并HCC患者、丙型肝炎合并HCC患者、乙型肝炎合并肝硬化患者、丙型肝炎合并肝硬化患者、单纯乙型肝炎患者和单纯丙型肝炎患者，采用ELISA检测血清中GPC3蛋白;采集HLA-A2阳性健康志愿者外周血，用Ficoll密度梯度离心法提取单个核细胞，进行DC和TC培养，转染pEF-hGPC3质粒，用MTT法检测各组免疫细胞杀伤作用;用流式细胞仪分析DC细胞成熟情况。<br>　　结果：<br>　　1.通过各数据库共计获得278篇文献，依据纳入及排除标准，最后选取8篇文章11项研究，涉及805位肿瘤患者组以及483位对照组。采用随机效应模型进行meta分析并汇总各统计学指标。其汇总灵敏度、特异度、阳性似然比、阴性似然比及诊断比值比(95％CI)分别为荟萃分析结果如下:敏感性77％(95％CI:73-81％)，特异性80％(95％Ch68-88％)，阳性似然比PLR为3.8，阴性似然比NLR为0.29，诊断比值比DOR为13.0。此外，绘制了SROC曲线，其曲线下面积为0.81。<br>　　2.荧光免疫组织化学染色法检测结果显示，GPC3在肝癌组织中高表达，分化程度越低，恶性度越高，表达量越高;<br>　　3.实时荧光定量聚合酶链反应(Real Time-PCR)检测结果显示，GPC3在肝癌患者中高表达，癌中心较癌旁组织GPC3表达量高，低分化肝癌较中分化和高分化肝癌表达量高;<br>　　4.ELISA法检测血清标本结果显示，GPC3在肝癌血清中高表达，且与在肝癌组织表达具有一致性，即分化程度越低，表达量越高;GPC3与肝炎病毒量具有一定的关联性，肝炎患者经抗病毒治疗后，GPC3表达量较未经抗病毒治疗的肝炎患者表达量降低;同时乙肝阳性的肝癌患者较乙肝阴性的肝癌患者GPC3表达量高，低分化肝癌较高分化肝癌GPC3表达量高;<br>　　5.采集HLA-A2阳性健康志愿者外周血，用Ficoll密度梯度离心法提取单个核细胞，进行DC和CTL培养，转染pEF-hGPC3质粒，MTT法检组免疫细胞杀瘤效果发现最佳效靶比为20∶1，最佳杀伤时间为48h，GPC3致敏DC的CTL杀瘤效果最强，混合抗原荷载DC的CTL的杀瘤效果次之，空载DC的CTL杀瘤效果最弱;<br>　　6.流式细胞仪分析DC成熟情况，发现GPC3特异性抗原致敏DC组CD80和CD86及CD83的表达最高，混合抗原荷载DC组次之，常规DC组最低。<br>　　结论：<br>　　1.let-7家族可用于肿瘤无创性筛查，需要在大规模的应用研究中验证。<br>　　2.GPC3是肝癌相关的重要抗原，与肝癌恶性程度呈正相关。<br>　　3.GPC3在肝癌患者组织中高表达，表达量与恶性程度成正比，肿瘤中心位置较癌旁位置表达量高。<br>　　4.GPC3在肝癌患者血清中高表达，在乙肝阳性的肝癌患者较阴性的肝癌患者表达高，低分化肝癌患者较高分化肝癌患者表达高。<br>　　5.血清GPC3阳性表达率与肝癌TNM分期以及肿瘤分化程度具有相关性，而与患者年龄、性别无关，患者分期越晚，分化程度越低，GPC3表达越高，表明GPC3作为一个特异性的肿瘤标志物，对于预测肿瘤的恶性程度，病情轻重以及预后有重要价值。