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摘要谷氨酸脱羧酶（glutamate decarboxylase，GAD; EC4.1.1.15）能以磷酸吡哆醛(PLP)为辅酶专一性地催化L-谷氨酸脱羧合成γ-氨基丁酸(γ-aminobutyrate，GABA)，是生物催化法制备GABA的唯一酶。GABA是一种天然存在的非蛋白质氨基酸，具有降血压、镇静安神、改善睡眠和记忆力等多种重要的生理功能，在食品、医药、畜牧业、农业等领域都具有广阔的应用前景。但由于天然的GAD存在酶活低、热稳定性差的缺陷，在大规模生成GABA的应用中受到了很大的限制。本研究以短乳杆菌GAD为父本酶，利用拉氏图获取蛋白质结构信息，通过定点突变的方法对GAD进行分子改造。<br>　　首先，以热稳定性和活性为筛选目标，通过研究短乳杆菌GAD1407三维模拟结构的拉氏图，确定不稳定氨基酸残基位点K413，采用定点突变的方法构建该位点的突变体，测定野生型酶和突变酶的热稳定性和活力。结果表明突变酶K413A和突变酶K413I分别在热稳定性和酶活力上获得了提高，突变酶K413A在50℃的半衰期为105 min，是野生酶的2.1倍;突变酶K413I热稳定性没有明显的提高，但其酶活力却得到了有效提高，约为野生型的1.6倍。对突变酶K413A和突变酶K413I的酶学性质分析表明，两种突变酶底物亲和力(Km)与野生型酶相差不大，而突变酶K413A和突变酶K413I的转化数(Km)分别是野生型酶的133％和167％。通过三维结构模型分析，发现突变酶对于催化活力和热稳定性的改善主要由于增加了蛋白质分子内的疏水相互作用。<br>　　为了进一步比较突变酶K413A和野生型酶的热稳定性，以盐酸胍和脲为变性剂，利用荧光检测法对野生型酶和突变酶K413A的去折叠过程进行研究。结果表明:在激发波长为280 nm时，以盐酸胍作为诱导剂时，两种酶中色氨酸的最大发射峰都会发生红移，色氨酸荧光强度呈现先上升再下降的趋势;以脲作为诱导剂时，两种色氨酸的最大发射峰也都会发生红移，色氨酸荧光强度下降。突变酶K413A和野生型酶去折叠过程的荧光相图检测结果表明，无论是以盐酸胍还是脲作为诱导剂，两种酶的去折叠过程都符合“三态模型”，说明随着变性剂浓度的增加，野生型酶和突变酶K413A先从天然态转变为部分折叠中间态，并最终转变为去折叠状态。此外，还考察了变性剂对酶活力的影响，当以盐酸胍为变性剂时，野生型酶和突变酶K413A半失活的盐酸胍浓度分别为0.4 mol/L和0.7 mol/L;当以脲为变性剂时，野生型酶和突变酶K413A半失活的脲浓度分别为1 mol/L和2 mol/L，由此可知，在变性剂存在的条件下，突变酶K413A的稳定性优于野生型酶。<br>　　本研究不仅获得了催化活力和热稳定性提高的GAD突变酶，为GABA的生物制备提供了催化性能提高的突变酶，而且还建立了一种基于拉氏图获取结构信息预测有效突变位点的方法，为谷氨酸脱羧酶酶学性质的提高提供了新的思路。