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摘要以非结合胆红素升高为主的先天性高胆红素血症在临床中并不罕见，其中最常见的为1901年Gilbert和Lereboullet发现的Gilbert综合症，其次为Arias在1962年发现的Crigler-Najjar综合症Ⅱ型(CNS-Ⅱ)，最少见也最为致命的是1952年被Crigler和Najjar报道的Crigler-Najjar综合症Ⅰ型(CNS-Ⅰ)。GS、CNS-Ⅰ和CNS-Ⅱ发病机制相同，均为编码尿苷二磷酸葡糖醛酸基转移酶1A1(UDP-glucuronosyltransferase1A1，UGT1A1)的基因发生突变，使突变的UGT1A1酶催化非结合胆红素的活性下降。<br>　　目前已发现了130个UGT1A1基因上的突变位点，这些突变点大多位于外显子1、2、5上，而外显子3、4上的突变相对较少[1]。课题组前期研究发现了1例CNS-Ⅱ患者携带有外显子上的纯合突变c.1091C＞T。该突变点位于UGT1A1基因外显子4上，使UGT1A1酶的第364个氨基酸由脯氨酸突变为亮氨酸(P364L)。<br>　　以往的研究中关于P364L突变的报道较少，在非亚洲人群中至今还没有该突变位点的报道，而课题组发现的CNS-Ⅱ患者携带P364L纯合突变，是目前为止报道的第1例。为明确P364L突变酶对非结合胆红素催化能力的影响我们构建变异体进行实验。<br>　　目的:UGT1A1基因外显子4上的突变c.1091C＞T，导致UGT1A1酶的第364个氨基酸由脯氨酸突变为亮氨酸，本实验旨在验证P364L突变酶催化非结合胆红素葡糖醛酸化能力的下降。<br>　　方法:以携带正常UGT1A1基因的野生型质粒为模板，用核苷酸引物介导的定点突变法构建携带c.1091C＞T基因的突变型质粒。突变型质粒测序并将测序结果与野生型质粒比对，验证突变型质粒是否构建准确。用突变型质粒和野生型质粒分别转染HEK293细胞，表达P364L突变酶和UGT1A1野生酶。提取用野生型质粒和突变型质粒分别转染HEK293细胞后表达的总RNA，逆转录合成cDNA。实时荧光定量方法分别检测野生型质粒和突变型质粒表达的差异。超声破碎仪裂解HEK293细胞，低温高速离心后留取上清。Western blot验证UGT1A1野生酶及P364L突变酶的表达。绘制非结合胆红素标准曲线，用UGT1A1野生酶和P364L突变酶分别催化非结合胆红素与尿苷二磷酸葡糖醛酸(Uridine diphosphate glucuronic acid,UDPGA)的结合反应，高效液相色谱仪（High performance liquid chromatograph，HPLC）定量分析非结合胆红素浓度的变化，比较UGT1A1野生酶和P364L突变酶对非结合胆红素葡糖醛酸化的催化活性。<br>　　结果:1.测序结果显示野生型质粒UGT1A1基因的第4个外显子上的第1091个碱基由鸟嘌呤(G)突变为腺嘌呤(A)，对应到互补链为胞嘧啶(C)突变为胸腺嘧啶(T)，突变质粒构建成功。<br>　　2.Western blot检测HEK293细胞转染UGT1A1野生型和P364L突变型质粒后的蛋白表达，PVDF膜扫描显示55KD左右处可见UGT1A1蛋白表达。<br>　　3.提取野生型、突变型质粒分别转染HEK293细胞后表达的总RNA，实时荧光定量PCR结果显示野生型质粒和突变型质粒表达无差异。<br>　　4.绘制非结合胆红素标准曲线，得到方程式:y=0.0571x+0.1011，R2=0.9946（其中X为非结合胆红素峰面积，Y为非结合胆红素浓度μg/mL），非结合胆红素浓度在0.31255μg/mL～5μg/mL时与非结合胆红素峰面积有良好的线性关系。<br>　　5.用分别转染P364L突变质粒和UGT1A1野生质粒后的HEK293细胞均浆催化非结合胆红素与UDPGA的酯化反应，UGT1A1野生酶和P364L突变酶反应组在15min内非结合胆红素浓度下降幅度最大，总体来讲P364L突变酶催化组非结合胆红素的浓度下降低于UGT1A1野生酶催化组。<br>　　结论:UGT1A1基因外显子4上的突变c.1091C＞T使其翻译合成的P364L突变酶催化非结合胆红素能力低于UGT1A1野生酶。