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摘要研究目的:<br>　　1.探讨UTMD调节SDF-1/CXCR4轴促静脉移植MSCs迁移归巢的作用及可能分子机制，为超声联合微泡作用下移植MSCs有效归巢缺血心肌提供理论依据;<br>　　2.探讨诊断超声联合携SDF-1微泡促静脉移植的MSCs归巢缺血心肌，改善大鼠心肌梗死后心功能的可行性和有效性，并初步探讨其机制。<br>　　研究方法:<br>　　1.人骨髓源性与大鼠骨髓源性间充质干细胞的分离、培养、鉴定及标记<br>　　分别通过密度梯度离心法和全骨髓贴壁培养法对成人骨髓源性间充质干细胞(Bone marrow derived mesenchymal stem cells，BMSCs)和大鼠BMSCs进行分离、纯化及培养，前者用于体外机制研究，后者用于动物体内的细胞移植。检测细胞周期、细胞生长曲线、超微结构。流式细胞仪检测细胞表面标记分子，成脂及成骨诱导分化对细胞进行鉴定。为在动物体内示踪外源性MSCs，用携带增强型GFP的慢病毒转染大鼠MSCs，转染48h后观察MSCs的绿色荧光表达及细胞毒性反应。<br>　　2.大鼠急性心肌梗死模型的建立与评价<br>　　采用结扎冠状动脉左前降支的方法建立大鼠心肌梗死模型。模型评价方法:HE染色、Masson染色以及超声心动图检测左室收缩功能。<br>　　3.UTMD上调SDF-1/CXCR4表达促心肌梗死后MSCs迁移归巢的机制研究<br>　　(1)体外辐照参数筛选:按照均匀实验设计，考察影响超声辐照效果的三个主要参数:超声辐照时间、辐照强度和微泡浓度。通过对SDF-1分泌量和人MSCs细胞存活率的检测，优选最佳的体外辐照参数配比。<br>　　(2)体外部分机制研究:本部分实验全部使用成人MSCs。为充分验证研究假设，制备两种条件培养液用于体外模拟正常或缺氧的心肌环境:①正常氧含量或低氧含量环境下人心肌细胞和人心肌微血管内皮细胞共培养的上清液;②正常或MI大鼠心肌组织提取液(myocardial tissue extracts，MTE)。据此把体外机制实验分为“上清液部分”和“MTE部分”。运用优化的超声辐照参数，考察UTMD对不同条件培养液中MSCs的影响。考察指标包括:CCK-8法检测MSCs的存活率，ELISA法检测SDF-1、黏附分子VCAM-1和ICAM-1的表达量，流式细胞仪检测MSCs膜CXCR4表达，Western blot法检测MSCs胞内CXCR4蛋白表达，荧光实时定量PCR法检测MSCs的CXCR4基因表达水平，Transwell迁移实验评估MSCs的体外迁移能力。<br>　　(3)体内部分机制研究:本部分实验使用大鼠MSCs。GFP标记的MSCs移植MI大鼠48h后，观察外源性MSCs在静脉移植MSCs组和超声联合微泡+MSCs组缺血心肌区的荧光分布，并计数阳性细胞用于统计学比较;未进行GFP标记的MSCs移植MI大鼠7d后，免疫组化法和Western blot法检测各组（对照组、静脉移植MSCs组、超声+微泡组以及超声+微泡+MSCs组）心肌缺血区SDF-1和CXCR4的表达。<br>　　4.超声联合携SDF-1微泡促MSCs靶向归巢并改善大鼠心肌梗死后心功能的研究<br>　　(1)携SDF-1微泡的制备及检测:在本科室普通脂质微泡制备方法的基础上，用共价结合法制备携SDF-1的微泡，光镜观察其形态、分布，颗粒计数仪检测其粒径、浓度，流式细胞仪检测SDF-1携带率、ELISA法检测SDF-1携载量和包封率。<br>　　(2) UTMD对缺氧预处理MSCs的影响:本部分实验使用成人MSCs，考察微泡联合超声对缺氧预处理MSCs的影响。将MSCs置于低氧环境(1％O2，94％ N2，5％ CO2)中暴露24h进行缺氧预处理。超声辐照后用CCK-8法检测细胞存活率、流式细胞仪检测膜CXCR4表达、Transwell迁移实验评估其体外迁移能力。<br>　　(3)动物实验:本部分实验全部使用缺氧预处理的大鼠MSCs用于移植治疗。GFP标记的MSCs移植48h后，观察外源性MSCs在静脉移植MSCs组、MSCs+UM组（普通微泡）以及MSC+UMSDF-1组（携SDF-1微泡）缺血心肌区的荧光分布;未进行GFP标记的MSCs移植28d后，免疫组化法检测各组（对照组、静脉移植MSCs组、MSC+UM组以及MSC+UMSDF-1组）心肌缺血区肝细胞生长因子(HGF)的表达，Western blot法检测SDF-1和血管内皮细胞生长因子(VEGF)的表达水平，HE染色法检测心肌缺血区血管密度(capillary density，CD)，M型超声评价左室收缩功能。<br>　　研究结论:<br>　　1.成功实现成人MSCs和大鼠MSCs的分离、纯化、培养及鉴定。按照MOI=10可成功转染携带增强型GFP的慢病毒到大鼠MSCs，转染效率高且传代后荧光表达稳定，可标记MSCs用于体内示踪。<br>　　2.使用优选出的体外超声辐照参数(频率=1MHz，T=30s，Q=0.6W/cm2，MB=106/mL)，微泡联合超声作用于人MSCs，可在较高细胞存活率的前提下，促进SDF-1及黏附分子VCAM-1和ICAM-1的分泌。还可上调MSCs膜CXCR4的表达，这可能得益于超声“声孔效应”和超声辐照后MSCs胞内CXCR4储备的增加。<br>　　3.采用缺氧条件下心肌细胞和心肌血管内皮细胞上清液与心肌梗死组织提取液两种条件培养液与MSCs进行共培养，均证实UTMD是通过上调SDF-1/CXCR4表达促MSCs归巢迁移这一分子机制。<br>　　4.诊断超声联合微泡作用于MI模型大鼠，可促进经静脉移植的MSCs向缺血心肌归巢，并提高缺血心肌区SDF-1、CXCR4的表达。其中，SDF-1的高表达可能是微泡介导的超声生物学效应作用于靶区和UTMD上调MSCs旁分泌共同作用的结果。<br>　　5.靶区SDF-1表达量的增加，与外源性MSCs在超声作用下膜CXCR4的表达上调，可能是UTMD上调SDF-1/CXCR4表达从而促进MSCs迁移归巢的两个相互作用的关键分子靶点。<br>　　6.采用共价连接法可成功制备粒径小，浓度高，分布均匀，连接稳定，有较高携载量和包封率的携SDF-1微泡。<br>　　7.缺氧预处理可使MSCs膜CXCR4表达上调，微泡联合超声作用可进一步促进其功能性表达，均有利于MSCs的迁移、归巢。<br>　　8.携SDF-1微泡在超声作用下靶向释放形成的SDF-1局部高浓度，和缺氧预处理及超声辐照引起的MSCs膜CXCR4表达上调，二者相互作用，共同促进外源性MSCs迁移归巢到缺血心肌。<br>　　9.经静脉移植MSCs在携SDF-1微泡联合超声作用下，归巢的MSCs数量进一步增加，并通过超声空化效应和归巢MSCs的旁分泌效应提高心肌缺血区VEGF和HGF的表达，促进血管新生来改善血流灌注，更有效改善心肌缺血后心功能。