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摘要研究背景及目的:膀胱癌是我国泌尿系统最常见的恶性肿瘤，占泌尿系恶性肿瘤的90％以上，占全身恶性肿瘤的1％-2％，是一种直接威胁患者生命的疾病。膀胱癌病理类型主要是尿路上皮癌，根据其浸润深度可分为非肌层浸润性和肌层浸润性膀胱癌两种类型。初诊患者中70％-80％为分化良好的非肌层浸润性癌，临床主要采取经尿道膀胱肿瘤切除术辅以膀胱内灌注化疗方法治疗，总体预后较好，仅10％进展为肌层浸润性癌，但术后复发率很高，需要时常监测，因此造成巨大经济负担;肌层浸润性膀胱癌恶性程度高，治疗金标准是根治性膀胱切除术，同时辅以系统性化疗，尽管如此，其术后2年内复发率及转移率达50％，5年生存率仅27％-50％，且长期化疗毒副作用大、因此总体预后很差，所以发现新的诊断及治疗方式显得尤为重要。随着分子生物学技术的发展，人们发现癌基因、抑癌基因、小分子RNA等均可参与膀胱癌的发生与发展，然而由于分子特异性差靶向基因治疗并未取得良好的疗效，因此人们亟待发现新的特异的诊疗靶标。<br>　　膀胱癌的发生机制非常复杂，包括癌基因c-Myc、h-ras、EGFR、HER2等的激活和抑癌基因p21、p53、Rb、p16ink4a/p19ink4b等的失活，近年来的研究发现某些线粒体DNA和能量代谢相关的蛋白也能参与肿瘤的发生和发展，如线粒体蛋白质翻译延伸因子Tu(TUFM)、细胞色素B(Cytb)、线粒体DNA亚基ND6等，这也使得线粒体与肿瘤的关系研究受到极大关注;同时研究也证实线粒体功能异常是恶性肿瘤的一大特点，这不仅归功于癌基因/抑癌基因的调控，还与肿瘤组织内缺氧微环境相关。缺氧普遍存在于实体肿瘤甚至血液系统肿瘤中，它能够调控线粒体的结构和功能，导致线粒体基因的功能改变，从而影响肿瘤细胞的能量代谢及生物学行为。线粒体核糖体蛋白S5(mitochondrial ribosomal protein S5，MRPS5)属于真核细胞线粒体核糖体28S小亚基成员，位于2p11.2-q11.2，含430个氨基酸，分子量48KDa，主要功能是参与合成线粒体氧化磷酸化的13种蛋白。最近的研究发现MRPS5通过线粒体能量代谢障碍途径调控线虫及小鼠的寿命。已知衰老是肿瘤发生的易感因素，如膀胱癌发病率随年龄增加而增加;且长寿调控基因Sir2、daf-2、lin2、dct2、nnt-1等均参与肿瘤的发生和发展。同时，前已述及线粒体结构异常或功能障碍是肿瘤的重要特征，而MRPS5作为线粒体结构组分且通过线粒体机能障碍途径参与调控动物的寿命，我们由此推测它可能与肿瘤的生物学行为密切相关。关于MRPS5对膀胱癌的生物学行为的影响国内外尚无报道，因此，我们对其功能开展了初步的研究。本研究中，我们首先对MRPS5在膀胱癌及癌旁正常组织中的表达以及MRPS5受缺氧影响的情况进行了观察，在此基础上，通过慢病毒载体技术干扰膀胱癌T24细胞中MRPS5的表达，探讨常氧及缺氧下MRPS5对膀胱癌细胞相关生物学行为的影响，旨在为膀胱癌的诊疗提供新的潜在靶标。<br>　　研究方法与主要内容:<br>　　一、检测MRPS5在膀胱癌组织及缺氧T24细胞中的表达情况<br>　　膀胱癌及其配对癌旁组织来自第三军医大学西南医院泌尿外科行膀胱癌手术的患者，经伦理委员会批准，获得患者知情同意。采用Western Blot技术检测这12对膀胱癌及癌旁正常组织中MRPS5的表达情况;同时，膀胱癌T24细胞经常氧(21％ O2)和缺氧(1％O2)处理(24hr)后，利用Western Blot分别检测MRPS5表达。<br>　　二、干扰MRPS5对常氧和缺氧下膀胱癌T24细胞生物学行为的影响<br>　　为探讨MRPS5对T24细胞生物学行为的影响，我们构建了慢病毒干扰载体Lv-shMRPS5。以事先备好的Lv-shScramble为对照，慢病毒干扰载体Lv-shMRPS5感染T24细胞72hr后，用Western Blot检测MRPS5的表达以确认干扰载体的有效性。T24细胞分为实验组(Lv-shMRPS5)及对照组(Lv-shScramble)，分别在常氧(21％ O2)和缺氧(1％O2)下培养。T24细胞经各慢病毒感染72hr后，Western Blot检测T24中HIF-1、PDK1、PKM2等与糖酵解相关的蛋白表达，以CellTiter-Blue Cell Viability Assay检测细胞活力，Western Blot检测增殖细胞核抗原PCNA的表达，流式细胞技术检测细胞凋亡及周期分布，Transwell小室检测细胞迁移能力，Western Blot检测上皮间质化(Epithelial-Mesenchymal Transitions，EMT)相关蛋白ZEB1、Slug、vimentin表达，超低粘附96孔板细胞成球实验反映细胞成球能力，Western Blot检测干性相关蛋白Nanog、Oct4、c-Myc、Sox2的表达， NOD/SCID小鼠皮下种植T24细胞以反映T24细胞体内成瘤能力。<br>　　实验结果:MRPS5在膀胱癌组织中的表达明显高于癌旁正常组织，且缺氧(1％O2)能刺激T24细胞MRPS5表达。构建的慢病毒干扰载体能降低T24细胞中MRPS5表达。常氧和缺氧时，干扰T24细胞中MRPS5的表达均可降低HIF-1、PDK1、PKM2等与糖酵解相关的蛋白，细胞增殖活力下降(P＜0.05)，PCNA表达显著减少，而细胞周期阻滞于S期，细胞早期凋亡率明显增加。常氧下Transwell结果显示干扰MRPS5对T24细胞的迁移能力无影响，且EMT相关蛋白ZEB1、Slug、vimentin表达也均无改变。细胞成球实验显示，干扰MRPS5后两组成球率无差异(P＞0.05)但细胞球直径明显减小，同时常氧及缺氧时干性转录因子Nanog、Oct4、c-Myc、Sox2的表达也随之下调。小鼠体内成瘤实验结果表明，干扰MRPS5后小鼠成瘤时间延迟，且6周后瘤体平均重量较轻(P＜0.05)、体积较小(P＜0.05)。<br>　　结论:膀胱癌组织中MRPS5表达水平较高。干扰膀胱癌T24细胞MRPS5的表达可显著下调糖酵解相关蛋白的表达，降低细胞增殖能力，减弱细胞的干性特征，降低其在小鼠体内的成瘤能力，但不影响膀胱癌T24细胞的迁移能力。缺氧可提高T24细胞MRPS5的表达，干扰MRPS5能降低HIF-1的表达，说明MRPS5与缺氧之间存在一定关系，但在缺氧情况下，干扰MRPS5的表达后，其对T24细胞生物学行为的影响与常氧情况类似。