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摘要纤维二糖酶是纤维素酶的重要组分之一，在纤维素酶水解纤维素的过程中，可将纤维二糖转化为葡萄糖，解除纤维二糖对于内切型-β-葡聚糖酶以及外切型-β-葡聚糖酶的反馈抑制。针对里氏木霉（Trichoderm reesei）纤维素酶制剂中纤维二糖酶活力明显偏低，纤维素酶对纤维素的协同降解效率不高这一技术瓶颈，本文对黑曲霉纤维二糖酶基因的克隆及其在大肠杆菌、毕赤酵母、里氏木霉菌丝细胞中的表达进行了一系列研究。<br>　　采用PT-PCR法，从黑曲霉中克隆得到全长2583bp，可编码860个氨基酸的纤维二糖酶基因(cb)，将该基因插入到大肠杆菌表达载体pET-28a(+)中，得到重组质粒pET28a(+)-cb。将该质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，获得了重组菌E.coliBL21(DE3)/pET28a(+)-cb，经IPTG诱导表达后，SDS-PAGE结果显示，在100 kDa处获得了与黑曲霉纤维二糖酶大小吻合的条带。该研究结果证明了黑曲霉纤维二糖酶基因的完整性，为后续的研究工作奠定了基础。<br>　　将黑曲霉纤维二糖酶基因同毕赤酵母表达载体pPIC9K连接，构建重组质粒pPIC9K-cb，采用电转化法，将重组质粒转入毕赤酵母GS115中，经过G418抗性平板筛选，得到8株高拷贝的阳性转化子。PCR检测结果显示，目的基因已经整合到染色体DNA上，且得到的转化子都为甲醇利用型(Mut+)毕赤酵母。重组子可以在以纤维二糖为唯一碳源的培养基中生长。当甲醇浓度为1％，培养基pH为5.0时，产酶6d，纤维二糖酶活力可达到8.58 IU/mL。该结果表明黑曲霉纤维二糖酶基因在毕赤酵母表达体系中得到了成功的分泌表达，该研究成果对于推动纤维二糖酶的规模化生产具有重要意义。<br>　　采用PCR方法，从里氏木霉基因组中克隆获得纤维二糖水解酶Ⅰ启动子(Pcbh1)、终止子(Tcbh1)序列以及丙酮酸激酶启动子(Ppki1)序列，从质粒pCAMBIA1301中克隆得到大肠杆菌潮霉素B磷酸转移酶基因(hph)。以PUC18为初始载体，将黑曲霉纤维二糖酶基因插入到Pcbh1和Tcbh1之间，构建得到含Pcbh1-cb-Tcbh1表达盒的重组载体pPBT，同时将Ppki1和hph连接，构建成含Ppki1-hph表达盒的重组载体pPH4。将PBT片段插入到pPH4载体中，使之位于hph基因序列之后，构建得到表达载体pHB9。该表达载体含有里氏木霉强启动子Pcbh1以及丝状真菌筛选标记，对于外源基因在丝状真菌中的表达具有重要意义。<br>　　采用原生质体法将重组表达载体pHB9转入里氏木霉分生孢子，对转化条件进行了优化:孢子萌发8h后，蜗牛酶酶解1h，使原生质体浓度达到5×108个/mL，采用60％ PEG6000转化环状质粒pHB9。转化效率可达到99-113个转化子/μgDNA。从487株阳性转化子中筛选得到10个优良重组子，PCR检测结果显示，目的基因已经整合到染色体DNA上。产酶试验结果表明:培养48h，重组子的纤维二糖酶活力(CB)最高可达到5.3 IU/mL，是原始菌株的106倍。滤纸酶活力(FPA)从原来的3.0 IU/mL提高到4.33 IU/mL，使CB/FPA值达到1.22。该值的提高有利于纤维素糖化效率的提高。该结果证明里氏木霉原生质体转化平台已经成功建立，并且实现了黑曲霉纤维二糖酶基因在里氏木霉中的分泌表达，这对于里氏木霉的定向进化具有重要意义。<br>　　将Pcbh1-cb-Tcbh1表达盒和Ppki1-hph表达盒分别同表达载体pCAMBIA1300连接，构建了适用于农杆菌介导转化的重组载体pCHB18，经农杆菌介导转入里氏木霉分生孢子，获得阳性重组子1056个，转化效率达到565-610个转化子/107孢子。对12个优良重组子的稳定性检测结果显示:转化子的遗传稳定性高达100％。产酶48h，重组菌株的纤维二糖酶活力可达到原始菌株的206倍。该研究成果对于外源基因在里氏木霉中的高效表达具有重要意义。<br>　　经前期试验得到3个优良重组子:T.reesei-1、Treesei-2、T.reesei-3。对重组子的产酶性能进行了研究，结果表明:重组子T.reesei-3产纤维二糖酶活力最高，在4％乳糖诱导条件下，培养108h，纤维二糖酶活力可达到30.02IU/mL，是相同条件下原始菌株（T.reesei ZU-02）纤维二糖酶活力的143倍，该研究结果明显高于国内外同类文献报道水平。然而，该重组子的滤纸酶活力低于原始菌株。重组子T.reesei-1的滤纸酶活力最高，在2％乳糖/2％微晶纤维素诱导作用下，产酶132h，滤纸酶活力可达到11.03 IU/mL，原始菌在该条件下的滤纸酶活力为9.91IU/mL。Treesei-1滤纸酶活力的提高对于其在纤维素酶水解中的应用具有重要意义。然而该菌株的纤维二糖酶活力在3株重组子中最低。重组子T.reesei-2的纤维二糖酶活力和滤纸酶活力介于T.reesei-1和T.reesei-3之间。<br>　　在4％葡萄糖诱导下，T.reesei ZU-02，T.reesei-1不能分泌产纤维二糖酶和纤维素酶。T.reesei-2纤维二糖酶和滤纸酶活力也仅为1.34 IU/mL和1.78 IU/mL。然而，T.reesei-3在该条件下纤维二糖酶活力可达到10.58 IU/mL，滤纸酶活力也可达到3.5 IU/mL。该结果表明，T.reesei-3在以葡萄糖为唯一碳源的条件下，仍然可以大量分泌纤维二糖酶以及内切酶，外切酶。该重组子的获得对于深入研究里氏木霉的诱导表达具有重要意义。<br>　　对纤维二糖酶在纤维素水解过程中的协同降解性能进行了研究，结果表明;在里氏木霉纤维素酶对纤维素的水解体系中，加入纤维二糖酶制剂，可以明显提高纤维素的糖化效率，酶解得率可以从76.8％提高到92.6％。采用重组里氏木霉所产的纤维素酶制剂酶解纤维素，无需补加纤维二糖酶，酶解得率即可以达到92.1％。该研究成果对于可再生资源的生物催化与转化具有重要的促进作用。<br>　　本文从高产纤维二糖酶的黑曲霉中克隆获得纤维二糖酶基因，并进一步实现了该基因在毕赤酵母和里氏木霉中的分泌表达，获得高产纤维二糖酶的重组子，以及滤纸酶和纤维二糖酶都提高的重组子。有关研究成果对于丝状真菌基因克隆表达体系的构建，以及高分解活性纤维素酶的定向进化，可再生植物纤维原料的催化具有重要意义。