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摘要哺乳动物核转录因子NF-κB家族蛋白在免疫系统中扮演着一个重要的角色，它通过调节与淋巴细胞发育以及生存相关的一些基因的表达，来参与免疫应答。IκBs家族蛋白作为NF-κB的一种抑制剂，它可以保持NF-κB为一种静息的状态。七鳃鳗作为脊椎动物上最低等的一个物种，为研究脊椎动物的起源提供了线索。虽然NF-κB信号通路在高等脊椎动物中研究较多，但是在七鳃鳗中的研究却未见报道。经过实验室的工作，我们首次在七鳃鳗的淋巴细胞cDNA文库中搜索到了与高等哺乳动物NF-κB1和IκB-ε同源的EST序列，并克隆了2个基因的cDNA全长，命名为NF-κB1-like和IκB-ε-like。七鳃鳗NF-κB1-like cDNA全长序列带有一个长度为2940bp，979个氨基酸的ORF区。含有一个171bp5'-UTR和一个1799-bp的3'-UTR，在3'-UTR末端含有一个多聚腺苷酸加尾信号(AATAAA)。七鳃鳗IκB-ε-like cDNA全长序列带有一个长度为272bp，424个氨基酸的ORF区。而且还有一个354bp5'-UTR和一个2014-bp的3'-UTR，在3'-UTR末端也有一个多聚腺苷酸加尾信号。序列比对显示，七鳃鳗NF-κB1-like和IκB-ε-like分别与高等脊椎动物中的对应基因有着很高的同源性。NF-κB1-like的N端带有一个高度保守N端RHD结构域（Rel同源区），这是NF-κB家族的标志性结构域，在序列的中段含有一个甘氨酸富集区(GRR)，在序列的C端，存在7个高同源性锚定蛋白重复序列(ANK)。IκB-ε-like在N端含有一个DSGxxS结构域，其在IκB-ε抑制NF-κB的方面发挥着重要的作用，在序列的C端含有6个保守的锚定蛋白重复序列。进化树分析显示，NF-κB1-like和IκB-ε-like分别被分到了NF-κB1和IκB-ε的那一簇，并且位于进化树的最底端。<br>　　构建pET32a-NF-κB1-like2，pET32a-NF-κB1-like3和pET32a-IκB-ε-like原核表达重组质粒，进行表达分别得到58kDa，41kDa和36kDa重组原核蛋白。利用亲和层析的方法对这些蛋白进行纯化，并制备得兔抗IκB-ε-like，兔抗NF-κB1-like2，兔抗NF-κB1-like3和鼠抗NF-κB1-like2多克隆抗体。免疫印迹实验表明，我们制备的抗体既识别重组表达的蛋白，也特异性识别七鳃鳗类淋巴细胞内的蛋白。EMSA实验结果表明七鳃鳗NF-κB1-like2蛋白具有特异性结合DNA的功能。构建pIRES2-AcGFP1-NF-κB1-like2，pcDNA3.1-NF-κB1-like3和pcDNA3.1-IκB-ε-like真核表达载体，随后转染到HEK293T细胞中。RT-PCR实验结果表明pIRES2-AcGFP1-NF-κB1-like2转染后能够促进L-6,IL-1和TNF-α转录水平的上调，而当共转染pIRES2-AcGFP1-NF-κB1-like2和pcDNA3.1-NF-κB1-like3时这种作用又会减弱，这表明pcDNA3.1-NF-κB1-like3对pIRES2-AcGFP1-NF-κB1-like2产生了抑制作用。除此之外，免疫共沉淀暗示，这种抑制通过二者的相互结合来实现。激光共聚焦结果显示NF-κB1-like2可以入核表达，而且同样这种入核会受到NF-κB1-like2蛋白的抑制。这一结果与western blot对于胞浆蛋白和胞核蛋白的分析相一致。为了研究NLS在NF-κB1-like中的作用，我们构建了NLS缺失的突变型质粒pIRES2-AcGFP1-NF-κB1-like1。激光共聚焦结果显示，缺失了NLS的NF-κB1失去了入核的功能。七鳃鳗淋巴细胞在LPS持续免疫的作用下，IκB-ε-like会随着时间的进行逐渐降解，这说明其参与了七鳃鳗的固有免疫应答且作用方式类似于哺乳动物的IκBs家族蛋白。免疫共沉淀和RT-PCR分析，NF-κB1-like和IκB-ε-like并不具有相互作用，并且IκB-ε-like不能够显著抑制NF-κB1-like的功能。<br>　　总之，本实验室首次得到了七鳃鳗NF-κB1-like和IκB-ε-like cDNA全长序列。NF-κB1-like2通过RHD的结构，可以特异性结合DNA，并且能够促进IL-6,IL-1和TNF-α基因转录水平的上调表达。而带有ANK结构域的NF-κB1-like3蛋白可以通过和NF-κB1-like2蛋白的相互作用抑制其活性。当七鳃鳗淋巴细胞受到LPS刺激时，IκB-ε-like会逐渐降解。对这些试验数据的分析指出，NF-κB1-like和IκB-ε-like在七鳃鳗的免疫系统中都扮演了十分重要的角色。