检索历史 清除

摘要目的：<br>　　1、探究基因Pk(Pyruvate Kinase)在小鼠胚胎干细胞、成纤维细胞及小鼠各个组织器官的表达情况，验证M2型丙酮酸激酶(Pyruvate Kinase SubtypeM2 Pkm2)在小鼠胚胎干细胞及诱导多能干细胞中高表达。<br>　　2、探究ES细胞中及重编程过程中癌基因Pkm2，与Pkm2表达调控相关的部分基因的表达情况。探究分化过程中与分化相关的三个胚层基因的表达变化，Pkm2，Pkm1，多能性基因Nanog，Oct4及与Pkm2表达调控相关基因的表达变化，进一步验证干细胞与Pkm2的相互关系。<br>　　3、胚胎干细胞中能够指示Pkm2表达的红色荧光报告系统的建立。<br>　　4、利用转座子系统及能够指示Pkm2表达的红色荧光报告系统，筛选出对Pkm2的表达起调控作用的新基因、新蛋白，并进一步研究该基因及蛋白与Pkm2的相互作用及在重编程过程中的功能。<br>　　方法：<br>　　第一，得到由C57BL/6小鼠制备的小鼠成纤维细胞(Mouse EmbryonicFibroblasts，MEF)，来源于129系小鼠的胚胎干细胞R1及由MEF诱导来的多能干细胞LiPS-37，然后分别提取C57BL/6小鼠的各个组织、器官，通过实时定量PCR的方法，检测这些小鼠特定的组织、器官及MEF、R1、LiPS-37等细胞系中Pk三个同工酶(Pkm1、Pkm2、Pklr)的表达情况。同时，检测ES及重编程过程中Pkm2及与Pkm2表达调控相关的基因的表达情况，另外在小鼠胚胎干细胞R1中进行维甲酸(Retinoic Acid，RA)、去除白血病抑制因子(Leukemia Inhibitory Factor，LIF)和除去饲养细胞(Feeder Cell)或者是促进拟胚体(Embryoid Body，EB)的形成等处理，使得R1分化，观察在分化过程中基因Pkm1和Pkm2，多能性基因Nanog和Oct4，与胚胎发育相关的三个胚层的基因Pax6、Foxa2、Gata6的表达变化，以及与Pkm2调控相关的部分基因的表达变化。<br>　　第二，借助于CRISPR/Cas9系统及同源重组的方法，根据小鼠胚胎干细胞染色体癌基因Pkm2的基因序列设计sgRNA及两个特定的同源臂，将能够编码红色荧光蛋白(Red Fluorescent Protein，RFP)的基因克隆到两个特定的同源臂之间，构建指示癌基因Pkm2红色荧光蛋白表达的载体，然后将这种载体瞬转到小鼠胚胎干细胞R1细胞系中，Cas9复合体能够通过向导序列(guide sequence)与DNA靶位点结合，在sgRNA存在的情况下，RFP会特异性的并插入到小鼠胚胎干细胞染色体Pkm2基因的特定位置，可以用来指示Pkm2在小鼠胚胎干细胞R1细胞系的表达情况，并且将得到的该细胞系进行分化处理，直接观察红色荧光的亮度变化。<br>　　第三，利用转座子随机插入基因组的方法，在该指示Pkm2表达的红色荧光细胞系中筛选出能够对于红色荧光有影响的新基因、新蛋白，并进一步研究新基因、新蛋白与Pkm2的相互关系及在重编程过程中的功能。<br>　　结果和结论：<br>　　（一）癌基因Pkm2的特异性表达及在分化、重编程过程中发挥着重要作用<br>　　癌基因Pkm2特异性在小鼠胚胎干细胞R1、诱导多能干细胞LiPS-37中表达量较高，并且Pkm2在重编程过程中表达逐渐增高，在分化过程中表达逐渐降低。<br>　　（二）建立红色荧光蛋白指示Pkm2表达的报告系统及阳性细胞系的纯化及扩增建系<br>　　运用CRISPR/Cas9系统及同源重组的方法，将sgRNA及同源臂导入到癌基因Pkm2表达量较高的胚胎干细胞R1中，我们可以看到有红色荧光表达的阳性细胞，对这些阳性的细胞进行挑单克隆及扩增建系，最终得到了纯化的含有红色荧光表达的R1细胞系。<br>　　（三）利用转座子随机筛选的方法筛选对Pkm2表达调控起作用的新基因、新蛋白<br>　　我们首先在293T细胞中验证了该转座现象，为进一步在ES细胞及iPS细胞中筛选对Pkm2的表达起作用的新基因、新蛋白打下了坚实的基础。