检索历史 清除

摘要背景:<br>　　白血病是一类造血干祖细胞的恶性克隆性疾病，根据白血病细胞的分化成熟程度和自然病程，将其分为急性和慢性两大类，其中急性白血病又以急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)最常见，发病率为1.62/10万。目前治疗AML的方法主要有常规化疗、异基因造血干细胞移植(Allogeneichematopoietic stem cell transplantation，allo-HSCT)。常规化疗以蒽环类药物联合阿糖胞苷作为治疗方案。allo-HSCT预处理化疗则以白消安（busulfan，BUS）联合环磷酰胺(cytoxan，CTX)作为基础的方案。由于这些化疗药物具有明显的毒副作用，常常导致机体多脏器的损伤及免疫系统受抑制，最终患者因出现多重感染及多器官功能衰竭而死亡。因而治疗相关性死亡率明显增高。另外，AML患者无论接受常规化疗还是异基因造血干细胞移植都往往面临白血病难治复发问题。而复发的根源在于患者体内存在白血病干细胞(leukemia stem cells，LSCs)。LSCs是一群存在于患者体内数量极少的白血病细胞，它们具有广泛的自我更新、迅速增殖和分化能力的肿瘤干细胞。它最重要的特点之一是化疗耐药性对，对常规化疗药物敏感性低。即便是大剂量化疗，往往也不能将其彻底从体内清除，最终导致白血病的复发。因此，要想预防AML复发以达到根治目的，就必须以LSCs为靶进行治疗或增加LSCs对常规化疗药物的敏感性。<br>　　BUS是一种双甲基磺酸酯类烷化剂，临床上常用治疗慢性髓细胞白血病。另外，它还与CTX组成异基因造血干细胞移植中常用的基本预处理方案。取得了与CTX/TBI相当甚至优于其的预处理疗效。因此，BUS/CTX预处理方案得到了广泛的应用。有研究表明，BUS在预处理过程中起到清髓作用，有效清除机体造血干祖细胞及白血病细胞。然而，其对机体正常细胞的毒副作用同样明显。往往出现多种并发症，因此，如果要保证BUS在预处理中的疗效，又要降低其对患者机体正常细胞、组织和器官的损伤作用，就必须利用毒性低化疗增敏剂来增强BUS对肿瘤细胞尤其是肿瘤干细胞的杀伤力，以求降低BUS在预处理方案中的使用剂量，达到高效低毒的效果。<br>　　姜黄素(Curcumin，CUR)是一种源自于姜科或天南星科植物根茎的橙黄色的多酚类化合物。近十年国内外对CUR开展了大量的体内外研究。结果发现，CUR对细胞、组织及器官具有多种药理作用，包括抗肿瘤、抗炎抗氧化、抗血管形成、清除氧自由基等。值得注意的是，在抗肿瘤方面，已经证实其在多种实体瘤及白血病中具有化疗增敏和放疗增敏的作用并能保护放化疗过程中正常体细胞。与其相关的机制也得到了深入的研究，CUR往往能够作用于肿瘤细胞的多个信号通路，包括凋亡、细胞周期、增殖、转移、侵袭、生存和血管形成等方面。并且作用的信号通路的多个位点。因此，CUR是一个多通路、多位点的抗肿瘤药物，具有广阔的开发和应用价值。更可贵的是，CUR是一种极易获取、价格低廉、对机体毒性作用极低的药物，为其进一步推广提供了有利的前提。总之，综合CUR的各种优点，CUR极有可能成为治疗急性髓系白血病的化疗增敏剂。<br>　　KG1a细胞株是一种人源急性髓系白血病细胞株，使用含10％胎牛血清的完全培养基置于5％CO2中即可传代培养。目前认为CD34+CD38-是LSCs的常见表型。研究证明，KG1a细胞株中含有较多的CD34+CD38-急性髓系白血病干祖细胞。尤其经过磁珠筛选后的KG1a细胞，其比例可高达95％以上。另外，CD34+CD38KG1a细胞株相对于其他白血病细胞株具有更强的化疗药物抵抗性，且能够在NOD/SCID小鼠体内增殖分化，形成白血病。因此，在许多研究中被认为KG1a细胞是较为可靠的LSCs体内外模型。<br>　　总之，为探索高效低毒的白血病化疗方案及异基因造血干细胞移植预处理方案，降低治疗相关死亡率和白血病复发率。本研究课题以CD34+CD38KG1a细胞株作为研究靶细胞，探讨BUS、CUR及两药联合在体外培养条件下对靶细胞的杀伤作用及可能的分子机制。以求为临床应用CUR作为BUS化疗增敏剂提供实验支持和依据。<br>　　第一章 姜黄素联合白消安对CD34+CD38KG1a细胞的协同致死效应<br>　　目的:<br>　　探讨姜黄素(Curcumin，CUR)、白消安(Busulfan，BUS)单药及两药联合KG1a细胞的抗肿瘤效应，并探讨两药联合对靶细胞的协同杀伤效应。<br>　　方法:<br>　　流式细胞术检测KG1a细胞与HL-60细胞的细胞表型，比较两种细胞的CD34+CD38-细胞比例。设置6个不同浓度CUR、BUS单药作用KG1a细胞24h、48h、72h后，使用MTT法检测单药对KG1a细胞的增殖抑制作用并计算出IC10、IC30、IC50、IC80。应用Compusyn软件计算两药联合对靶细胞的协同杀伤效应。然后用IC30单药及联合作用靶细胞48h。在此基础上，使用流式细胞术(Flowcytometry，FCM)检测各组细胞的凋亡率和细胞周期分布情况，甲基纤维素克隆形成实验分析各组细胞自我更新及增殖能力。Western blot法检测各组细胞的凋亡标志蛋白cleaved PARP、caspase-3的表达情况。<br>　　统计学方法<br>　　数据以x±s表示，采用SPSS13.0统计软件进行数据收集和统计分析。两组独立样本均数间比较采用t检验，多个独立样本均数间比较采用One-wayANOVA进行统计，两两比较时用LSD-t法。对不同时间点、不同药物浓度对KG1a细胞增殖抑制作用的分析，使用析因设计资料的方差分析，P＜0.05时具有统计学意义<br>　　结果:<br>　　KG1a细胞的免疫表型以CD34+CD38-为主，占（92.5±0.4）％;HL-60细胞的免疫表型以CD34+CD38+为主，占（62.3±0.3）％。各浓度CUR对KG1a细胞均具有增殖抑制作用，且表现出剂量和时间依赖性。在24h时，各浓度BUS对KG1a细胞增殖抑制作用不明显;48h、72h时，各浓度BUS对KG1a细胞具有增殖抑制作用，且呈时间剂量依赖性。联合组的细胞抑制率与单药组间存在明显差异，具有统计学意义（*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001）。药物联合指数CI＜1，提示联合用药具有明显的协同效应。CUR、BUS都对KG1a细胞的克隆形成能力具有抑制作用，具有浓度剂量依赖性，差异具有统计学意义（*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001）。联合用药组的KG1a细胞克隆集落明显较单药密度低。药物联合作用的细胞凋亡率要比单药作用高。CUR、BUS使KG1a细胞阻滞于S期，两药联合作用KG1a细胞后，S期及G2/M期细胞显著增加。CUR联合BUS作用KG1a细胞后，与对照组和单药组相比，cleaved PARP表达水平显著提高，而caspase-3表达水平则显著下调。<br>　　结论:<br>　　1.CUR、BUS对KG1a细胞具有增殖抑制作用，且具有一定的时间和剂量依赖性。<br>　　2.CUR与BUS联合后可以具有协同抑制KG1a细胞增殖的作用。<br>　　3.两药联合作用KG1a细胞后，可以增加靶细胞的凋亡，细胞凋亡率（早期+晚期）明显较单药高，凋亡标志蛋白明显上调/下调。<br>　　4.两药联合后，部分细胞发生凋亡，存活的细胞被阻滞于S期和G2/M期。<br>　　第二章 姜黄素、白消安单药及两药联合诱导急性髓系白血病干细胞KG1a细胞凋亡的分子机制<br>　　目的:<br>　　探讨CUR、BUS及两药联合诱导急性髓系白血病干细胞KG1a细胞凋亡的分子机制。<br>　　方法:<br>　　取CUR、BUS的IC30作用KG1a细胞48h后，收集细胞提取细胞总蛋白，应用RayBiotech蛋白芯片技术同时检测43个人类凋亡相关蛋白分子表达水平，并分析比较各组细胞的凋亡相关蛋白表达水平，使用western blot法验证蛋白表达的改变。<br>　　统计学方法<br>　　各组蛋白分子表达水平以荧光强度值表示，各组之间比较的阈值设为1.5或0.667，即＞1.5或＜0.667提示两组间该凋亡蛋白表达水平存在差异性。<br>　　结果:<br>　　显著上调的凋亡蛋白分别为bad、caspase-3、HTRA，显著下调的凋亡蛋白分别为bcl-2、XIAP、c-IAP、survivin。CUR组、联合药物组的survivin蛋白条带明显较对照组、BUS组暗淡，提示survivin的表达水平下调。与蛋白芯片检测结果一致。<br>　　结论:<br>　　1.经CUR、CUR+BUS作用KG1a细胞48h后，靶细胞的43个凋亡相关蛋白中的3个显著上调的促凋亡蛋白分别为bad、caspase-3、HTRA，显著下调的4抗凋亡蛋白分别为bcl-2、XIAP、c-IAP、survivin。这7个凋亡相关蛋白很可能与CUR联合BUS的凋亡增效有关。<br>　　2.CUR组、联合药物组的survivin蛋白条带明显较对照组、BUS组暗淡，提示survivin的表达水平下调。与蛋白芯片检测结果一致。<br>　　3.CUR、CUR+BUS作用KG1a后，survivin表达水平下调（抑制性作用），而survivin又是SMAC、caspase-9等促凋亡蛋白分子的抑制性分子，故survivin的表达下调能够增加KG1a的凋亡效应。