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摘要妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus，GDM)是指妊娠期首次发生或发现的任何程度的糖耐量受损，不包含部分妊娠前已患有糖尿病但产检时首次被诊断的患者。这是一种妊娠期常见的并发症之一。目前，越来越多的研究显示，生活方式、β细胞功能缺陷、炎症因子及脂肪因子等多种因素参与了GDM的发病机制。<br>　　MicroRNA(miRNA)是一类普遍存在于动植物中的长度约为22nt的内源性非编码小RNA分子，迄今为止，大约有2000多种miRNA被发现鉴定，它是生物体内最丰富重要的一类基因调控因子，研究发现miRNA参与了细胞凋亡、细胞增殖分化、癌症发生、生长发育、病毒感染、炎症等过程。<br>　　本实验研究GDM的一般临床特点及胎盘组织的组织学变化，利用Illumina高通量测序平台来筛选GDM与正常妊娠女性胎盘组织中差异表达的miRNAs，对得到的部分miRNA差异表达谱进行实时荧光定量PCR(qRT-PCR)验证，借助生物信息学方法预测并初步分析差异表达miRNAs的靶基因功能和通路，为深入探讨GDM的发病机制奠定基础。<br>　　第一部分GDM的临床特点及胎盘组织学改变<br>　　目的:分析GDM及正常妊娠妇女临床特点及各自胎盘组织病理学的变化，探讨GDM对胎盘结构和功能的影响。<br>　　方法:选取于2013年1月1日至2014年1月1日在广州医科大学附属省武警医院、南方医科大学珠江医院就诊并分娩的孕妇40例，均为粤籍汉族人并且相互之间无亲缘关系，将妊娠期糖尿病孕妇作为观察组（GDM组），随机选取同期无妊娠合并症或并发症的正常孕妇作为对照组。纳入标准为2013年世界卫生组织（world health organization，WHO）妊娠期糖尿病诊断标准;排除对象包括合并存在妊娠期高血压疾病、原有糖尿病、先天性心脏病、双胎妊娠、早产、肝炎、甲状腺功能异常等代谢性疾病、产前发热等炎症急性期孕妇。收集GDM组及对照组的一般临床数据和血液标本检测空腹血糖、餐后血糖、空腹胰岛素、餐后胰岛素等指标，计算稳态模型胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)和稳态模型下的胰岛细胞功能指数(HBCI);取胎盘组织进行组织病理学检查。<br>　　结果:与对照组相比，GDM组空腹血糖、餐后2h血糖、餐后2h胰岛素、糖化血红蛋白和HOMA-IR均明显升高，差异有统计学意义（依次为t=48.036，P=0.000; t=25.586，P=0.000; t=-109.543,P=0.000; t=29.072，P=0.000; t=29.899,P=0.000);而GDM组空腹胰岛素、HBCI水平明显低于对照组，差异有统计学意义（依次为t=-39.235，P=0.000; t=-37.389，P=0.000）。光镜下GDM胎盘组织发生小动脉血管壁绒毛壁增厚，合胞体结节明显增多、合体膜形成等。统计分析显示GDM胎盘组织的结构变化与对照组相比差异有统计学意义(依次为x2=8.538，P=0.003; x2=25.658，P=0.000;x2=19.948，P=0.000;)。<br>　　结论:GDM者基础胰岛素分泌降低伴有胰岛素分泌的紊乱及胰岛素功能的抵抗，会导致胎盘组织结构变化、进而影响其功能。<br>　　第二部分GDM胎盘组织miRNAs差异表达筛选分析<br>　　目的:通过新一代Illumina高通量测序技术平台筛选并分析广东汉族妊娠期糖尿病妇女胎盘组织与正常妊娠妇女胎盘组织的miRNAs之间的表达差异。<br>　　方法:选取第一部分收集到的GDM病例40例及正常对照40例。胎儿分娩后收集胎盘组织，用Trizol法进行总RNA的提取，经过质量和纯度分析鉴定合格后分别选取10个样本混合成GDM和对照组，采用逆转录法构建小RNA文库，使用第二代高通量测序平台HiSeq2000测序仪采用边合成边测序的方法对miRNA测序并分析结果。设定阈值大于2倍以上为上调，小于0.5倍为下调。<br>　　结果:1从GDM组和对照组胎盘组织提取出质量和纯度合格的总RNA，并成功构建小RNA的cDNA文库。2采用高通量测序得到长度为10-35nt的小RNA片段，其中文库数量最多的小RNA长度在21nt-24nt，miRNA量占所有小RNA总量的30％以上，最终获得洁净的片段超过10000000。将得到的片段与Genebank及Rfram数据库比对去除其他小RNA筛选出miRNA的种类数达7000多种。GDM组的miRNA条目数及总量都要多于对照组。3通过样本两两比较分析，与对照组相比，发现GDM组有138种己知的miRNA表达明显上调，包括hsa-miR-548am-5p、hsa-miR-95-5、hsa-miR-372-5p、hsa-miR-374a-5p、hsa-miR-1277-5p、hsa-miR-29a-3p、hsa-miR-889-3p等(log2-ratio＞1，P＜0.01);16种已知miRNAs明显表达下调，如hsa-miR-1269a、hsa-miR-1246、hsa-miR-663a、hsa-miR-7704等（log2-ratio＜-1;P＜0.01）。以上差异表达的miRNAs中包括了一些已经验证在糖尿病发病过程中起重要作用的miRNA。Mireap软件预测出19种新miRNA，这些新miRNA均有典型的二级茎环结构，在GDM组有9种新miRNA表达明显增高(log2-ratio＞1，P＜0.01)、6种新miRNA表达明显降低(log2-ratio＜-1，P＜0.01)和4种新miRNA表达与对照组无明显差别(-1＜log2-ratio＜1,P＞0.05)。<br>　　结论:通过构建GDM和正常妊娠妇女胎盘组织小RNA的cDNA文库并利用Illumina高通量测序技术平台，对GDM妇女胎盘组织miRNAs进行高通量测序研究，结合软件分析发现妊娠糖尿病的胎盘组织miRNAs与对照组存在表达差异。除现有研究发现的154种己知miRNA，我们还发现19种新的miRNA、其中15种存在表达差异。<br>　　第三部分miRNA差异表达结果的验证和靶基因的预测及功能分析<br>　　目的:利用qRT-PCR法验证高通量测序筛选出GDM与正常对照组胎盘组织中差异表达的miRNAs。对差异表达的miRNA进行靶基因的预测和功能分析。<br>　　方法:采用第二部分Trizol法提取得到GDM组和对照组的胎盘组织总RNA，使用商品化的试剂盒逆转录合成小RNA的cDNA。通过q-RTPCR法、采用Sybr-Green染料，以RNU6为内参基因，对测序法初筛选出有明显表达差异的hsa-miR-548am-5p、hsa-miR-95-5p、hsa-miR-1246、hsa-miR-1269a的表达量进行检测。miRanda，targetscan，Mireap三个软件预测miRNA作用的靶基因，并取三个结果的交集作为靶基因预测结果，应用GO和KEGG数据库对预测的靶基因的分子功能及通路进行富集分析，筛选GO及KEGG显著性差异的标准分别是P＜0.01、假阳性率(False discovery rate，FDR)＜0.05。<br>　　结果:与正常对照相比，GDM组胎盘组织的hsa-miR-548am-5p、hsa-miR-95-5p明显升高，差异有统计学意义（依次为t=-10.208，P=0.000;t=-14.880，P=0.000）;而hsa-miR-1246、hsa-miR-1269a表达明显降低，差异有统计学意义（依次为t=12.653，P=0.000;t=8.973，P=0.000），与测序结果一致。预测差异表达的miRNA靶基因数和靶基因位点数在GDM组都要多于对照组。hsa-miR-548am、hsa-miR-372、hsa-miR-374和novel-mir-22等预测到的靶基因有共同的部分。差异表达的miRNA靶基因GO富集分析显示这些靶基因的功能涉及到细胞增殖分化、大分子物质代谢、信号转导、免疫反应及糖尿病密切相关物质转运代谢等生物过程和功能。KEGG通路分析发现，GDM组KEGG通路的汇集的靶基因数量要多于正常对照组，差异表达miRNA对应的靶基因主要参与了肌动蛋白细胞骨架的调节、局部细胞粘附、细胞内吞作用、钙离子信号通路、趋化因子信号通路、Wnt信号通路、泛素介导的蛋白水解、胰岛素信号通路、细胞凋亡、过氧化物酶体增殖物激活受体和脂肪细胞因子信号通路等。<br>　　结论:qRT-PCR法确证通过高通量测序得到的miRNA差异表达结果可靠。发生GDM时胎盘组织miRNAs的靶基因调节位点发生变化。hsa-miR-130b-3p、hsa-miR-372-3p、hsa-miR-374b-5p、 hsa-miR-548am-5p、和novel-mir-22等差异表达的miRNA交互作用调节糖代谢及胰岛素信号通路关键靶点;novel-mir-14、novel-mir-19和novel-mir-22等主要作用于过氧化物酶体增殖物激活受体通路中的脂质的合成与分解代谢调节、胰岛素信号传导等。部分差异表达miRNA还参与了胎盘组织小血管的重构。