检索历史 清除

摘要全文分为三个部分进行探讨:<br>　　第一章 小鼠局灶性脑缺血性损伤后原蛋白转化酶1及神经肽Y表达变化研究<br>　　目的：<br>　　构建小鼠局灶性脑缺血再灌注模型，研究PC1及神经肽Y(neuropeptide Y，NPY)在小鼠脑缺血皮质中的表达及变化规律。<br>　　方法：<br>　　构建小鼠线栓法大脑中动脉阻塞模型，将小鼠随机分为:假手术组、缺血再灌注4h组、24h组，用TTC染色方法评估造模成功与否，出现神经功能缺损的小鼠用于后续实验。取小鼠脑组织制成冰冻切片，采用免疫荧光方法检测PC1蛋白表达。提取小鼠缺血侧皮质脑组织总RNA、总蛋白，采用实时荧光定量PCR及Western Blot技术检测PC1、NPY mRNA及蛋白在缺血再灌注各个时间点的表达量。<br>　　结果：<br>　　1.TTC染色结果显示，假手术组、缺血再灌注4h组TTC染色未见梗塞灶，缺血再灌注24h梗塞体积约为26±2％。<br>　　2.免疫组化结果显示:PC1主要表达于神经元胞体及轴突，假手术组PC1阳性细胞数为22.661±1.928％，缺血再灌注4h组为40.464±2.928％，缺血再灌注24h组为32.881±1.944％，各组间比较差异具有统计学意义(F=16.707，P=0.004，n=3)。与假手术组比较，缺血再灌注4h组、缺血再灌注24h组PC1阳性细胞数明显增多（P＜0.005）。<br>　　3.PC1蛋白表达水平变化<br>　　假手术组PC1前体proPC1(pro-proprotein convertase1，proPC1)相对表达量为0.112±0.010，缺血再灌注4h组为0.356±0.074，缺血再灌注24h组为0.228±0.048;各组proPC1表达量差异具有统计学意义（F=5.609，P=0.026，n=4）;与假手术组相比，缺血再灌注4h proPC1表达量明显增加，缺血再灌注24h出现下降趋势。<br>　　4.PC1 mRNA定量PCR检测结果<br>　　PC1 mRNA缺血再灌注4h组表达量为对照组的2.660±0.244倍，缺血再灌注24h组为2.068±0.226倍;各组间比较差异具有统计学意义（F=19.230，P=0.001，n=4）;与假手术组相比，缺血再灌注4h、24h PC1 mRNA表达量上调。<br>　　结论：<br>　　1)缺血性损伤可导致PC1 mRNA表达上调;2）缺血性损伤导致PC1以前体形式(proPC1)堆积;3）缺血性损伤导致proNPY堆积，可以间接反映PC1加工处理NPY神经肽的能力减弱。<br>　　第二章 小鼠局灶性脑缺血性损伤后嗜铬颗粒蛋白A的表达变化研究<br>　　目的：<br>　　检测缺血再灌注后嗜铬颗粒蛋白A(chromogranin A，CgA) mRNA、蛋白的表达及变化。<br>　　方法：<br>　　构建小鼠大脑中动脉阻塞模型，将小鼠随机分为:假手术组、缺血再灌注4h组、缺血再灌注24h组，采用实时荧光定量PCR及Western Blot方法检测缺血再灌注后CgA的mRNA、蛋白的表达量。<br>　　结果：<br>　　1.CgA蛋白Western Blot检测结果<br>　　Western Blot检测CgA条带分子量大小约50kDa左右，对照组为相对表达量为0.267±0.008，缺血再灌注4h组为0.199±0.032，缺血再灌注24h组为0.146±0.005。各组间差异具有统计学意义（F=17.121，P=0.003，n=3）;随着缺血再灌注时间的延长，4h组、24h组脑组织中活性CgA的含量降低。<br>　　2.CgA mRNA实时荧光定量PCR检测结果<br>　　缺血再灌注4h组相对表达量为对照组的1.214±0.295倍;缺血再灌注24h组为对照组的1.129±0.061倍，各组间差异无统计学意义(F=0.381，P=0.698，n=3)，缺血再灌注后CgA mRNA表达量无明显变化。<br>　　结论：<br>　　在小鼠缺血再灌注4h、24h活性CgA的蛋白表达量有下降，但mRNA表达量无明显变化，CgA在缺血性损伤中加工成熟障碍，在缺血性损伤中PC1加工神经肽底物的能力减弱。<br>　　第三章 神经细胞NS20Y氧糖剥夺后原蛋白转化酶1及嗜铬颗粒蛋白A表达变化研究<br>　　目的：<br>　　建立NS20Y氧糖剥夺模型，体外模拟神经元缺血性损伤，并检测PC1及其底物CgA的表达及变化，进一步研究PC1加工系统在体外缺血性损伤模型中的变化规律。<br>　　方法：<br>　　将适量NS20Y细胞均匀接种于培养皿中，给予含10％胎牛血清的DMEM常规培养。细胞生长至60-70％密度时加入环磷酸腺苷类似物cpt-cAMP使其浓度为10-4mol/L，诱导细胞分化及神经肽分泌。细胞诱导24h后用于氧糖剥夺(oxygen glucose deprivation，OGD)实验。诱导后的NS20Y用PBS清洗1次，实验组加入无糖DMEM培养基，对照组加入高糖DMEM培养基，实验组放入缺氧小室，缺氧小室内放入厌氧产气袋，缺氧小室密封放入细胞培养箱内培养，对照组直接放入细胞培养箱内正常培养。分别于缺氧的2、4、6h于缺氧小室内取出实验组细胞，换液加入高糖DMEM培养基正常氧浓度环境下培养过夜。实验组缺氧再灌注的12h后，终止细胞培养，提取细胞总蛋白、RNA。采用westernblot及实时荧光定量PCR检测PC1及CgA的表达。另外，OGD处理细胞及正常对照细胞用PBS清洗2次，每次10min，并用4％多聚甲醛固定15min，用于TUNEL染色及PC1免疫荧光染色。<br>　　结果：<br>　　1.NS20Y细胞OGD后细胞凋亡率检测<br>　　通过TUNEL染色，对照组细胞凋亡率为7.00±1.15％，OGD2h组细胞凋亡率为17.67±1.45％，OGD4h组的细胞凋亡率为28.67±0.88％，OGD6h组为33.00±0.58％。各组间比较差异具有统计学意义（F=119.57，P＜0.005，n=3）。总之，随着OGD时间的延长，细胞凋亡数增加，细胞缺血性损伤更加严重。<br>　　2.PC1细胞免疫荧光检测结果<br>　　随着OGD时间的延长，NS20Y细胞PC1免疫荧光强度有不同程度的增加，其中OGD6h增加最明显，约为对照组的3.667倍。<br>　　对照组平均细胞荧光强度为0.015±0.003，OGD2h组的平均荧光强度为0.023±0.005，OGD4h的平均荧光强度为0.038±0.006，OGD6h组的平均荧光强度为0.055±0.011。各组间差异有统计学意义（F=7.049，P=0.005，n=3）。两两比较采用LSD检验，对照组与4h组、6h组比较差异有统计学意义（P＜0.05），2h组与6h组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。<br>　　3.NS20Y细胞OGD后proPC1 Western Blot检测结果<br>　　proPC1在氧糖剥夺后有不同程度的表达增加。对照组为0.433±0.058，OGD2h组为0.713±0.060，OGD4h组为0.774±0.034，OGD6h组为0.735±0.020。各组间比较差异具有统计学意义(F=11.389，P=0.001，n=3)，对照组分别与OGD2h组、4h组、6h组比较差异具有统计学意义(P＜0.05)，OGD2h组、4h组、6h组各组间两两比较差异无统计学意义。<br>　　4.NS20Y细胞OGD后PC1 mRNA表达变化<br>　　OGD能诱导PC1 mRNA表达上调。OGD2h组PC1基因表达量为对照组的1.730±0.293倍，OGD4h组为对2.223±0.176倍，OGD6h组为2.373±0.274倍。各组间比较差异具有统计学意义(F=7.989，P=0.009，n=3)，OGD2h、4h、6h相比对照组PC1 mRNA表达量都有不同程度增加，但OGD2h、4h、6h各组两两比较差异无统计学意义。<br>　　结论：<br>　　1)NS20Y细胞OGD2h、4h、6h复氧12h后PC1 mRNA、proPC1蛋白表达量均有不同程度增加;2）NS20Y细胞OGD2h、4h、6h复氧12h后CgA mRNA表达量未见明显变化，但50kDa左右的CgA片段表达量下降;3）NS20Y细胞缺氧复氧后PC1以前体形式堆积，蛋白加工能力减弱，CgA成熟片段减少。<br>　　全文结论：<br>　　1)在体内外脑缺血性损伤模型中，PC1 mRNA表达有不同程度上调，PC1蛋白前体proPC1表达增加。<br>　　2)在体内外脑缺血性损伤模型中，PC1加工的神经肽底物CgA mRNA表达量无明显变化，但活性CgA的表达量下降，可以间接反映PC1在缺血性损伤后的加工能力减弱。<br>　　3)在小鼠局灶脑缺血性损伤模型中，PC1加工的神经肽底物NPY mRNA表达量上调，NPY的前体proNPY表达量增加，间接反映PC1在缺血性损伤后的加工能力减弱。<br>　　4)脑缺血性损伤后，PC1自身成熟及其加工活性受损，使一些具有神经保护作用的底物神经肽减少，从而加重脑缺血性损伤。