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摘要背景与目的：<br>　　核苷类药物(nucleos(t)ide analogues，NAs)是目前治疗CHB的常用药物之一。由于NAs在治疗CHB患者过程中，其应答率较高，每日仅需口服一次且副作用小，因此在临床上被广泛使用。但又因其治疗CHB疗程的长期性与不确定性，临床上患者自行停药、不规范停药的现象较为常见。CHB患者的不规范停药与自行停药会引起一系列不良的严重后果，包括病毒反弹、促进耐药与病情的进一步进展，造成后续治疗困难。NAs抗HBV治疗停药后的持久应答是我们期望的满意治疗终点。所谓持久应答，是指停药后至少一年，仍能保持治疗结束时的完全应答，即血清转氨酶复常、血清HBV DNA阴性且维持HBeAg血清学转换。<br>　　近年来有不少回顾性研究预测停药后持久应答，但主要集中在临床指标的分析上，包括患者年龄、血清HBsAg水平、HBeAg血清转换时HBV DNA水平、cccDNA水平、乙型肝炎病毒核心抗原相关抗原(HBcrAg)水平、口服NAs患者获得应答的时间和NAs巩固治疗时间等，较为一致的结论是:患者年龄越小、停药时血清HBsAg水平越低、HBeAg血清转换时HBV DNA水平越低、肝组织中cccDNA水平越低、血清HBcrAg水平越低、NAs治疗中获得完全应答时间越短、取得完全应答后NAs巩固治疗时间越长，停药后复发的机会越少。<br>　　然而，隐藏在这些临床常规指标后面的免疫学参数、以及其免疫控制持久应答的机制，尚待深入研究。白细胞介素-21（IL-21）是一种主要由活化的CD4+T细胞、NKT细胞和Th17细胞产生的多功能细胞因子。IL-21与IL-2、IL-4、IL-7、IL-9和IL-15一样拥有相同的细胞因子受体γ链即γc。它的多效性表现在:调控免疫球蛋白的生成，引导终末期B细胞分化成浆细胞，协同地扩展CD8+T细胞的增殖，引导Th17的分化，对树突状细胞的抗原提呈有抑制作用，可以促进B细胞和NK细胞凋亡。此外，IL-21具有抗肿瘤效应的可能，与病毒感染性疾病的发展相关。因此在体内调控IL-21的活动对于一部分疾病具有临床应用的潜力。<br>　　本研究通过随访并检测经NAs治疗停药后的CHB患者血清病毒学及生化学指标，探讨预测停药后持久应答的临床指标;通过检测停药患者血清IL-21的水平，探讨IL-21与停药后持久应答的相关性;通过检测停药患者机体HBV-特异性CD8+T细胞功能，分析血清IL-21水平与CD8+T细胞应答的关系，探讨停药患者维持持久应答的可能机制，为拓展IL-21和相关免疫细胞在慢性HBV感染者中的临床应用提供科学依据。<br>　　方法：<br>　　1.停药后临床指标的检测<br>　　对于治疗前HBeAg阳性停药患者，持续口服NAs治疗至HBV DNA在检测线以下、谷丙转氨酶(ALT)复常、HBeAg发生血清转换后再继续巩固治疗至少12个月;对于治疗前HBeAg阴性患者，治疗至HBV DNA在检测线以下、ALT复常后再继续巩固治疗至少18个月。所有病例均排除甲、丙、丁、戊型肝炎及其他病毒感染及自身免疫性肝病、肝硬化、肝细胞癌等。筛选合格患者按停药标准停药，停药后纳入我们的密切跟踪随访系统。所有受试者各随访点采清晨空腹静脉血30ml:其中抗凝血20ml，采用密度梯度离心法分离外周血单个核淋巴细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)，-80℃保存;促凝血10ml，离心后取上清置PC管中-20℃保存，同批检测。<br>　　本项研究已经在世界卫生组织国际临床试验注册平台注册(注册号:ChiCTR-ONRC-12002315)。经南方医科大学南方医院伦理委员会审批，本临床研究已经通过并批准进行(NFEC-201209-K3)。本研究每位入选患者都给予充分知情同意并书面签署知情同意书。<br>　　临床指标的实验室检测:生化学检测:采用Olympus AU5400全自动生化分析仪。病毒学检测:HBV DNA定量检测采用Combas荧光定量PCR法分析，采用微粒子化学发光法检测HBV血清标志物（HBsAg、 HBsAb、HBeAg、 HBeAb和HBcAb）。<br>　　2.血清IL-21水平的检测<br>　　采用双抗体夹心ELISA(eBioscience，San Jose，CA，USA)方法检测受试者血清IL-21水平。严格按照试剂盒说明书进行，取受试者血清及标准品各100ul加入酶标板，其中标准品做倍比稀释。终止反应后，采用酶标仪(FACSCalibur，BD，USA)测定吸光度(OD)值，以OD值计算IL-21水平。<br>　　3.HBV-特异性T细胞应答的检测<br>　　复苏冻存的PBMC，分为HBV核心肽库刺激孔与再刺激孔进行铺板，第四天加入IL-2，刺激十天后，采用细胞内细胞因子染色(Intracellular cytokinestaining，ICS)检测，检测前加入蛋白转运抑制剂(Brefeldin A，BFA)孵育5小时。表面标记抗体:7AAD-Percp，anti-CD3-FITC，anti-CD8-APC，胞内标记抗体:anti-IFN-γ-PE，洗涤后加300ul2％多聚甲醛固定，上机检测。结果计算:以再刺激孔IFN-γ+CD8+T细胞频数减去未再刺激孔 IFN-γ+CD8+T细胞频数大于0为HBV-特异性CD8+T细胞阳性。<br>　　结果：<br>　　1.CHB患者经NAs治疗停药后临床指标对持久应答的预测作用<br>　　60例符合停药标准的CHB患者停药，经51.3±1.9(48-56)周的随访，病毒学复发患者24例(40％)，其中临床复发13例(21.6％)（6例复发点为停药后第12周;7例复发点为停药后第24周），对于临床复发患者再次予核苷类药物抗病毒治疗，同时本停药研究的随访结束，纳入普通随访;持续应答患者36例。持续应答组患者在停药基线年龄及HBsAg滴度显著低于病毒学复发组(p=0.03，p=0.001)，但在性别比例、治疗前HBeAg状态、总治疗时间、应答时间以及巩固治疗时间上均无显著差异。<br>　　2.停药患者血清IL-21水平的动态变化<br>　　60例CHB患者停药基线、停药后第12周、第24周、第48周血清IL-21水平依次为40.90pg/ml(24.50-182.44pg/ml)、42.71p g/mi(24.50-156.16.17pg/ml)、42.68pg/ml(25.92-215.48pg/ml)、42.90pg/ml(27.35-200.85pg/ml)，停药后第12周、第24周、第48周与停药基线相比均无显著性差异;病毒学复发组停药基线、停药后第12周、第24周、第48周血清IL-21水平依次为42.68pg/ml(25.92-182.44pg/ml)、41.48pg/ml(24.50-150.16pg/ml)、45.68pg/ml(28.77-215.48pg/ml)、42.64pg/ml(27.35-200.85pg/ml)，其中停药后第12周、第24周、第48周与停药基线相比均无显著性差异。持续应答组停药基线、停药后第12周、第24周，第48周血清IL-21水平依次为39.59pg/ml(24.50-117.16pg/ml)、42.71pg/ml(25.92-114.53pg/ml)、40.84pg/ml(25.92-118.48pg/ml)、43.52pg/ml（28.77-128.65pg/ml），其中停药后第12周、第24周、第48周显著高于停药基线（分别p=0.0035，p=0.0124，p=0.0002）。<br>　　3.血清IL-21水平与血清HBsAg滴度及HBV DNA水平的关系<br>　　病毒学复发组血清HBV DNA水平随着随访时间延长呈持续上升趋势，血清HBsAg滴度无明显变化，血清IL-21水平亦无明显变化。而在持续应答组血清HBV DNA水平随着随访时间延长，呈持续稳定低水平，血清HBsAg滴度亦无明显变化，但血清IL-21水平在随访过程中呈稳定高水平状态。60例停药患者总血清IL-21水平与血清HBsAg滴度及HBV DNA水平间均无显著相关性;病毒学复发组及持续应答组血清IL-21水平与血清HBV DNA水平无显著相关性;病毒学复发组血清IL-21水平与血清HBsAg滴度呈正相关(r=0.290，p=0.01)，持续应答组血清IL-21水平与血清HBsAg滴度呈负相关(r=-0.328，p＜0.0001)。<br>　　4.HBV-特异性T细胞应答<br>　　我们对20例HLA-A2阳性患者停药基线HBV-特异性T细胞应答进行检测，HBV-特异性T细胞应答检出率为30％(6/20)，而IFN-γ+CD8+T细胞百分比为0.133％±0.062％（0.054％-0.228％），HBV-特异性T细胞应答在病毒学复发组与持续应答组患者分别检出2例(2/11)和4例(4/9)，两组间检出率无统计学差异。<br>　　结论:<br>　　停药基线时患者年龄及HBsAg滴度可作为较好的持续应答预测指标;持续应答患者停药后血清IL-21呈高表达状态;停药后血清IL-21水平在病毒学复发组和持续应答组分别与患者血清HBsAg水平呈正相关和负相关，这提示IL-21可能作为一种炎症因子及免疫调节因子在CHB患者停药后免疫控制中起到一定的作用。