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摘要随着免疫抑制人群的增加，侵袭性曲霉病（invasive aspergillosis，IA）的发病率呈上升趋势。近年来，宿主天然免疫在抗真菌感染中的作用和机制受到了广泛重视。模式识别作用是抗真菌天然免疫的始动环节，而模式识别受体(patternrecognition receptors，PRRs)是天然免疫应答的始动点。通过调节PRRs的表达，干预宿主天然免疫状态，成为曲霉防治的突破点。<br>　　树突状细胞相关C型凝集素-1(dendritic cell-associated C-type lectin-1，Dectin-1)是重要的PRRs，通过识别真菌细胞壁的β-1，3葡聚糖，在抗真菌免疫过程中发挥重要作用。既往研究表明，巨噬细胞培养基中添加Dectin-1胞外区蛋白能显著增强其杀灭曲霉的能力。小鼠体内试验也提示，经尾静脉注射表达Dectin-1胞外区蛋白的重组腺病毒能提高小鼠烟曲霉感染生存率。<br>　　肺泡巨噬细胞(alveolar macrophages，AMs)是下呼吸道抵御病原微生物入侵的第一道防线，通过受体介导的内吞和非特异性吞噬作用清除曲霉孢子，释放多种细胞因子，募集并激活中性粒细胞、单核细胞等其它免疫细胞至感染部位，并能调节促炎因子和抗炎因子的平衡，协同抗曲霉炎症反应。<br>　　本研究拟构建表达Dectin-1基因的重组腺病毒(Adenovirus，Ad)，并使其携带增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescence protein，EGFP)标记，通过转染AMs，建立Dectin-1高表达的细胞模型，观察烟曲霉感染过程中，Dectin-1高表达对AMs天然免疫防御功能的调节作用。<br>　　第一部分 重组腺病毒Ad-Dectin-1的构建及鉴定<br>　　目的:构建表达小鼠Dectin-1基因的重组腺病毒Ad-Dectinn-1，扩增、纯化获得高浓度的重组腺病毒。<br>　　材料与方法:构建Dectin-1-pIRES2-EGFP重组质粒，以该质粒为模板PCR扩增目的片段，将目的片段重组到中间载体pDONR221上，再与腺病毒骨架质粒pAD/CMV/V5-DEST重组，获得重组腺病毒质粒pAD-Dectin-1-pIRES2-EGFP，经PacⅠ线性化后转染人胚肾293(human embryo kidney，HEK293)细胞，收获重组腺病毒Ad-Dectin-1，利用HEK293细胞大量扩增腺病毒，浓缩和纯化收获高浓度腺病毒。Real-time PCR法检测Dectin-1基因mRNA表达量，半数组织细胞感染(tissue culture infective dose，TCID50)法测定腺病毒滴度。<br>　　结果:经酶切和菌落PCR鉴定证实重组腺病毒含有目的基因Dectin-1，Real-timePCR检测到Dectin-1表达量是空病毒对照组的8677倍，TCID50法测得浓缩和纯化后的重组腺病毒滴度为5×1011IU/ml。<br>　　结论:成功构建了表达目的基因Dectin-1的重组腺病毒Ad-Dectin-1，并获得了较高的腺病毒滴度。<br>　　第二部分 重组腺病毒Ad-Dectin-1转染小鼠肺泡巨噬细胞<br>　　目的:重组腺病毒Ad-Dectin-1体外转染小鼠肺泡巨噬细胞MH-S，构建Dectin-1高表达的细胞模型。<br>　　方法:重组腺病毒Ad-Dectin-1体外转染MH-S细胞(Ad-Dectin-1-EGFP组)，荧光显微镜观察转染情况，MTT法检测细胞增殖情况，确定转染的最佳感染复数（multiplicity of infection，MOI）值。Real-time PCR法检测Dectin-1基因mRNA表达量，Western blot检测Dectin-1蛋白表达量，激光共聚焦显微镜和流式细胞仪检测细胞膜表面Dectin-1表达情况。同时设不转染腺病毒的MH-S细胞为空白对照，转染空病毒的MH-S细胞为阴性对照（Ad-EGFP组）。<br>　　结果:重组腺病毒转染MH-S细胞12h即可见少量绿色荧光表达，48 h荧光强度达到峰值，MOI值为2200时细胞增值率下降，转染最佳MOI值为1800。Real-timePCR和Western blot检测发现，Dectin-1基因mRNA和蛋白表达量均较Ad-EGFP组显著增加。激光共聚焦显微镜和流式细胞仪检测进一步证实，细胞膜表面有Dectin-1表达，且表达量较Ad-EGFP组显著增加。<br>　　结论:重组腺病毒Ad-Dectin-1可在体外转染MH-S细胞，转染后Dectin-1基因mRNA和蛋白表达显著增加，Dectin-1高表达的细胞模型构建成功。<br>　　第三部分 Dectin-1高表达的小鼠肺泡巨噬细胞在烟曲霉感染中的作用<br>　　目的:探讨Dectin-1高表达对小鼠肺泡巨噬细胞抗烟曲霉感染能力的影响。<br>　　材料与方法:通过转染重组腺病毒Ad-Dectin-1构建Dectin-1高表达的MH-S细胞模型，用烟曲霉孢子感染，Real-time PCR检测炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-10mRNA的表达量，ELISA法检测细胞培养上清中TNF-α和IL-10的量，平板菌落计数法计算MH-S细胞对烟曲霉孢子的杀灭百分数。<br>　　结果:Real-time PCR和ELISA法检测结果表明，Dectin-1高表达的MH-S细胞在受到烟曲霉孢子刺激时，炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-10的表达量增加。平板菌落计数法结果显示，Dectin-1高表达的MH-S细胞对孢子的杀灭百分数显著高于对照组。<br>　　结论:在烟曲霉感染过程中，Decetin-1高表达的MH-S细胞炎症因子表达量增加，对烟曲霉孢子的杀灭能力增强，提示Dectin-1高表达可能通过调节天然免疫反应提高宿主抵抗曲霉感染的能力。