检索历史 清除

摘要背景:<br>　　乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，其中约90％患者表达雌激素受体α(estrogen receptorα，ERα)、孕激素受体(progesterone receptor, PR)或表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor2，HER2），内分泌治疗或分子靶向治疗可很大程度上改善这部分患者的预后。然而，原发性或获得性耐药的发生则给上述患者的治疗带来极大的挑战。此外，还有约10％的乳腺癌患者ER、PR和HER2受体均为阴性，即三阴性乳腺癌(triple-negative breast cancer,TNBC)，由于缺乏特异性的治疗靶点预后较差。因此，确定新的分子治疗靶点，对于临床乳腺癌患者的预后至关重要。目前，已有相当一部分研究开始关注乳腺癌治疗过程中复发和药物耐药的发生机制，并由此确立了一些新的、具有潜在应用价值的分子靶点，如细胞周期蛋白依赖性激酶4和6(cyclin-dependent kinase4 and6，CDK4/6)、Src、雄激素受体(androgen receptor, AR)等。此外，有研究证实，microRNAs（miRNAs）在乳腺癌中发挥着重要作用，为乳腺癌的治疗提供了实验依据。对于那些缺乏有效、特异性治疗靶点的肿瘤亚型，如TNBC，miRNAs也可能成为其新的治疗手段。将miRNA作为辅助工具应用于治疗似乎具有一定的前景。<br>　　目的:<br>　　本研究将对乳腺癌新的靶向治疗药物CDK4/6抑制剂帕博昔布(Palbociclib)在乳腺癌细胞中的作用进行研究，筛选相关的miRNAs，为进一步研究其作用机制、筛选预测药物疗效的分子标志物奠定基础;探究雄激素受体相关的miRNAs，并利用生物信息学技术探究其相关的信号通路及其miRNA-靶基因相互作用网络，为临床选择AR作为乳腺癌治疗靶点提供依据;探究miRNA在TNBC发生发展过程中的作用，为临床这一预后较差的乳腺癌亚型的治疗提供新的思路;研究Src抑制剂塞卡替尼(Saracatinib)对乳腺癌细胞中的作用，并建立对Saracatinib耐药的乳腺癌细胞株，筛选耐药细胞株与敏感细胞株之间差异表达的miRNAs，为进一步探究其耐药机制奠定研究基础。<br>　　方法:<br>　　本实验选取四种不同亚型乳腺癌细胞株:MCF-7（ER+，HER2-，AR+），SK-BR-3(ER-,HER2+,AR+),MDA-MB-231(ER-,HER2-,AR+),Hs578t（ER-，HER2-，AR+），分别进行以下几部分实验:<br>　　1.分别用不同浓度Palbociclib(IC50)处理上述四株细胞24 h，收集处理前后细胞，进行miRNA表达谱分析;<br>　　2.分析在四组细胞处理前后共同上调或下调的miRNAs，并进行PCR验证;<br>　　3.分析AR+/AR-细胞之间差异表达的miRNAs，并进行相关信号通路的富集分析，以及其miRNA-靶基因相互作用网络分析;<br>　　4.分析TNBC/non-TNBC细胞之间差异表达的miRNAs，并结合已有文献资料，综述miRNA在TNBC发生、发展过程中的作用;<br>　　5.采用低浓度诱导的方法建立对Saracatinib耐药的乳腺癌细胞株SK-BR-3/SI，进行耐药细胞株的鉴定，并通过miRNA表达谱分析耐药细胞株和敏感细胞株之间差异表达的miRNAs。<br>　　结果:<br>　　1.Palbociclib处理前后的四组细胞并没有共同上调或下调的miRNA;在MCF-7和SK-BR-3细胞处理组，miR-1321均上调;miRNA-29b-3p均下调（P≤0.05）;<br>　　2.AR+细胞（MCF-7，SK-BR-3，MDA-MB-231）与AR-细胞(Hs578t)相比，有52个miRNAs上调，101个miRNAs下调。这些差异表达的miRNAs参与多个与肿瘤相关的信号通路，如EGFR，mTOR等，并进一步分析了VEGF-miRNA-靶基因的相互作用网络;<br>　　3.TNBC细胞(MDA-MB-231，Hs578t)与non-TNBC细胞（MCF-7，SK-BR-3）相比，有4个miRNAs上调（miR-138-5p，miR-4324，miR-4800-3p，miR-6836-3p），8个miRNAs下调（miR-363-5p,miR-182-5p,miR-141-3p,miR-339-5p,miR-4655-3p,miR-4784,miR-664b-5p,miR-6787-5p）;有多个 miRNAs可参与TNBC发生、发展过程，如上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)(miR-155,miR-221)、转移(miR-17,miR-182);<br>　　4.Saracatinib耐药细胞株SK-BR-3/SI药物IC50为9.52μmol/L，敏感株SK-BR-3的IC50为4.85μmol/L;相比敏感细胞，耐药细胞上调32个miRNAs，下调36个miRNAs。<br>　　结论:<br>　　随着治疗过程中疾病复发和进展的发生率愈来愈高，以及TNBC本身缺乏特异性治疗靶点造成其预后较差的原因，寻找新的分子靶点已成为乳腺癌研究领域亟需解决的关键问题，而CDK4/6、AR和Src等分子正逐渐成为新的乳腺癌靶向药物的研究热点。利用高通量的技术手段，我们筛选了CDK4/6抑制剂处理前后乳腺癌细胞中差异表达的miRNAs，为进一步探究药物的作用机制、筛选预测药物疗效的分子标志物提供了研究依据;分析了AR+/AR-、TNBC/non-TNBC细胞中差异表达的miRNAs，并利用生物信息学软件预测其靶基因，甚至其参与的信号通路VEGF-miRNA-靶基因相互作用网络，从miRNA的角度分析了AR在乳腺癌发生发展过程中的作用，为临床选择AR作为TNBC治疗靶点提供依据;同时，在这些新药治疗过程中，难免会发生肿瘤细胞的耐药，我们通过小剂量逐渐递增的方法，建立了对Src抑制剂Saracatinib耐药的乳腺癌细胞株(SK-BR-3/SI)，并筛选了耐药株与敏感株之间差异表达的miRNAs，为进一步探究乳腺癌分子靶向治疗过程中耐药发生的机制奠定了基础。